UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA Y DE ALIMENTOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS EFECTOS DEL Lactobaci/lus.casei ATCC 393™ SOBRE EL Escherichia coli DURANTE LA VIDA COMERCIAL DEL QUESO FRESCO ;,t'" TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE INGENIERO DE ALIMENTOS· ERICK GEORGE ALVAREZ YANAMANGO Callao, Noviembre del 2011 PERÚ EFECTOS DEL Lactobacillus casei ATCC 393™ SOBRE EL Escherichia coli DURANTE LA VIDA COMERCIAL DEL QUESO FRESCO El presente trabajo de tesis titulado: "EFECTOS DEL Lactobacillus casei ATCC 393 TM SOBRE EL Escherichia coli DURANTE LA VIDA COMERCIAL DEL QUESO FRESCO", fue realizado por el Bachiller Erick George Alvarez Yanamango, bajo la supervisión del asesor Blgo. Enrique Barrientos A. y del Co-asesor Ms.Cs. Blgo. Edgar Zarate S. Blgo. DEDICATORIA A Juan Yanamango y Simón Flores, In memoriam, por sus enseñanzas y consejos dejadas tras sus partidas, por haber apostado y confiado en que este día llegaría. A mi madre, Elsa Yanamango, por ser muestra del sacrificio de toda una vida. ii AGRADECIMIENTO A Dios, por bendecir mi camino, por permitirme lograr las metas que he trazado en mi vida y por albergar en su seno a mis abuelos que aunque ya no estén físicamente, aún permanecen en nuestros corazones y son los mejores guías que uno puede tener. Al Dr. José Ramón Cáceres Paredes, Vicerrector de investigación, por todo el apoyo brindado para la realización de esta investigación, por su confianza y prestación mostrada desde el primer día de trabajo en el Centro Experimental Tecnológico (CET). Al Mg Se. Blgo. Edgar Zarate Sarapura, por ser el verdadero promotor de este trabajo de investigación, por el apoyo incondicional recibido, por permitirme aprender más de lo que me exigió la tesis, por ser guía, maestro y amigo. Al Blgo. Enrique Barrientos Aguilar, por todo el apoyo recibido, sobre todo por la predisposición mostrada desde el primer día que se inicio este proyecto. iii A mis compañeros del CET, por los buenos y malos momentos que hacen que uno madure en lo personal y profesional. En especial a Leynard Natividad, por su apoyo en la realización de las pruebas fisicoquímicas. A Gustavo Fuentes-Rivera y Alberto Hernández, amigos con quienes compartí la universidad y largas horas en el laboratorio, por encontrarse siempre dispuestos cuando fueron requeridos. A Cindy Casaverde, por su apoyo y comprensión, por hacer que retome la calma cuando las cosas salían fuera de sitio y sobre todo por brindarme su compañía, su atención y su cariño. A todo el personal del CET, por haberme atendido y albergado en todo este tiempo. Al Sr. Walter Paulina, por su di$posición en la solución de problemas técnicos de los equipos e instalaciones. A mis padres Simón y Elsa, ·por su cariño, protección y por todo el sacrificio realizado para sacarme adelante. A mis hermanos, por comprenderme y apoyarme en todo este tiempo, en especial a Wilmer, por estar siempre pendiente de mis pasos y por apostar en la realización de mis planes, proyectos y metas. iv ÍNDICE DE CONTENIDOS Pagina RESUMEN xi INTRODUCCIÓN xii CAPITULO 1 PROBLEMA 1.1 Formulación y definición del problema 1.2 Importancia 1.3 Justificación CAPITULO 11 OBJETIVOS 2.1 Objetivos general 2.2 Objetivos específicos 2.3 Alcances de la investigación CAPITULO 111 MARCO TEÓRICO ' ' ·- ' ' ~ - . - - 3.1 Antecedentes de la investigación 3.2 Revisión literaria 3.2.1 LECHE 3.2.1.1 Definiciones 3.2.1.2 Composición química de la leche 3.2.2 QUESO FRESCO 3.2.2.1 Características generales 3.2.2.2 Alteraciones del queso fresco 3.2.2.3 Conservantes en queso fresco 3.2.2.4 Elaboración de queso fresco 4.2.2.4.1 4.2.2.4.2 lnsumos Etapas de la elaboración de queso fresco 3.2.3 BACTERIAS ACIDO LACTICAS 3.2.3.1 características generales 1 4 4 6 6 7 8 14 14 14 15 19 19 22 23 25 25 28 33 33 3.2.3.2 3.2.3.3 3.2.3.4 V Efectos protector/inhibitorio de las BAL Características generales del género Lactobacillus Características generales de Lactobacil/us casei 3.2.4BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR LAS BAL 3.2.4.1 Características generales 3.2.4.2 Modo de acción de las Bacteoricinas 3.2.5 CRECIMIENTO BACTERIANO 3.2.5.1 Factores que influyen en el crecimiento bacteriano 3.2.5.2 Fases del crecimiento bacteriano 3.2.5.3 Modelamiento matemático del crecimiento bacteriano 3.2.5.3.1 Baranyi y Robert 3.2.6 Escherichia coli 35 38 39 41 40 44 47 47 48 51 52 55 3.2.6.1 Características ge!'1~r§!~~ 55 \";' - 3.2.6.2 Escherichia coli: indicador de Higiene 55 3.2.6.3 Escherichia coli entero patógeno. 57 3.2.6.4 Condiciones de crecimiento del Escherichia co/i 59 3.2.6.5 Escherichia coli ATCC 25922 61 3.2.7VIDA UTIL 3.2.7.1 Definición 3.2.7.2 Evaluación de la vida útil de un alimento CAPITULO IV MATERIALES Y MÉTODOS A. Lugar de ejecución B. Materia prima e Insumas C. Materiales y Equipos 4.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN 4.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.3 MÉTODOS DE ANÁLISIS 62 62 63 67 67 69 70 72 74 vi 4.3.1 Leche fresca 4.3.2 Queso fresco experimental 4.4 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN 74 78 81 4.4.1 Análisis de la materia prima 81 4.4.2Activación de las cepas experimentales 81 4.4.31noculación de las cepas experimentales 82 4.4.4 Elaboración del queso fresco 83 4.4.5 Evaluación de la vida útil del queso fresco 89 4.4.6 Efectos del Lactobacil/us casei ATCC 393™ sobre el 90 crecimiento del Escherichia co/i 4.4.7 Análisis estadístico de los resultados 94 CAPITULO V RESULTADOS CAPITULO VI DISCUSIÓN CAPITULO VIl CONCLUSIONES CAPITULO VIII RECOMENDACIONES CAPITULO IX REFERENCIAS ANEXOS 96 120 129 131 132 144 vii ÍNDICE DE TABLAS Pagina Tabla N° 1 Composición media de la leche cruda de algunas 16 razas vacunas (%p/p) Tabla N° 2 Requisitos Microbiológicos para el Queso fresco 20 Tabla N° 3 Composición química del queso fresco 21 ·Tabla N° 4 Conservantes permitidos para quesos no madurados 24 Tabla N° 5 Principales mecanismos de acción propuestas para 37 las bacterias probióticas Tabla N° 6 Caracteres de lg~ ~nferrn~qªges producidas por ECC 60 viii ÍNDICE DE CUADROS Pagina Cuadro N° 1 Resultados de las pruebas de estabilidad prácticas a la 98 leche destinada a la elaboración de quesos. Cuadro N° 2 Recuento de coliformes totales practicado a la leche 98 cruda y leche pasteurizada. Cuadro N° 3 Parámetros cinéticos promedios del crecimiento de 1 00 coliformes totales en quesos frescos almacenado a dos rangos de temperaturas: 8-1 O oc y 20-25 °C. Cuadro N° 4 Tiempo de vida útil estimado para el queso fresco 102 almacenado a dos rangos de temperaturas: 8-10 oc y 20-25 °C. Cuadro N° 5 Parámetros cinéticos de crecimiento de las bacterias 104 acido lácticas del queso fresco almacenado a 8-1 O °C y 20-25 °C. Cuadro N° 6 Parámetros cinéticos de crecimiento del Escherichia 106 co/i en el queso fresco (tr¡:;¡t~ry¡iento 1: control) Cuadro N° 7 Parámetros cinéticos de crecimiento y letalidad del 109 Escherichia co/i y Lactobacil/us casei en el queso fresco (tratamiento 2). Cuadro N° 8 Parámetros cinéticos de crecimiento y letalidad del 11 O Escherichia co/i y Lactobacillus casei en el queso fresco (tratamiento 3). Cuadro N° 9 Parámetros .cinéticos de crecimiento y letalidad ·del 112 Escherichia coli y Lactobacil/us casei en el queso fresco (tratamiento 4 ). Cuadro N° 10 Parámetros cinéticos ge crecimiento y letalidad del 114 Escherichia co/i de los c;uatro tratamientos Cuadro N° 11 Prueba de Tukey (HSD) entre los tratamientos, con un 117 intervalo de confianza de 95%. Cuadro N° 12 Valores de humedad de los correspondientes a vida . útil experimentales. quesos frescos y tratamientos 117 Cuadro N° 13 Valores de acidez titulable de los quesos frescos 119 correspondientes a vida útil y tratamientos experimentale.~- Figura N° 1 Figura N° 2 ix ÍNDICE DE FIGURAS Distribución de las proteínas de la Leche de vaca. Interacción de los monómeros de bacteriocina con la membrana citoplasmática: modelo de complejo de poración. Pagina 17 46 Figura N° 3 Curva típica de crecimiento bacteriano. 49 Figura N° 4 Parámetros cinéticos de crecimiento bacteriano en 53 una curva típica: Modelo Baranyi y Robert, 1994. Figura N° 5 Simulación de la estimación de la vida útil del queso 66 fresco a determinadas condiciones de almacenamiento. Figura N° 6 Galonera para ~1 transporte ~e la leche. 68 Figura N° 7 Diseño experimental del estudio. 73 Figura N° 8 Equipo de Medición de pH. 74 Figura N° 9 Titulación de la Leche 75 Figura N° 1 O Prueba de estabilidad frente al alcohol. 76 Figura N° 11 · Colonias coliform~s en j\gar Me Conkey 77 Figura N° 12 Colonias de BAL en Agar MRS. 80 Figura N° 13 Escalas Me Farland usadas como referencia 82 Figura N° 14 Diagrama de elaboración del queso fresco 84 experimental. X ÍNDICE DE GRAFICOS Pagina Grafica N° 1 Curvas de crecimiento promedio de coliformes totales 1 00 del queso fresco almacenado a dos rangos de temperaturas: 8-10 oc y 20-25 °C. Grafica N° 2 Estimación de la vida útil del queso fresco 102 almacenados a dos rangos de temperaturas: 8-1 O oc y 20-25 °C. Grafica N° 3 Curva de -crecimiento de Coliformes Totales y 105 Bacterias Acido Ládicas presentes en el queso fresco almacenado a 8-10 °C. Grafica N° 4 Curva de crecimiento de Coliformes Totales y 105 Bacterias Acido Lácticas presentes en el queso fresco almacenado a 20-25 °C. Grafica N° 5 Curvas de crecimiento de Escherichia coli inoculado 107 en el queso fre¡!sco (Tratamiento 1 o Control). Grafica N° 6 Curvas de crecimiento de Escherichia coli y 108 Lactobacil/us casei inoculados en el queso fresco (Tratamiento 2). Grafica N° 7 Curvas de crecimiento de Escherichia co/i y 111 Lactobacillus casei inoculados en el queso fresco (Tratamiento 3). Grafica N° 8 Curvas de crecimiento de Escherichia coli y 113 Lactobacil/us casei ·inoculados en el queso fresco (Tratamiento 4 ). · Grafica N° 9 Curvas de crecimiento promedio de EC de los cuatro 115 tratamiento. Grafica N° 1 O Evaluación de la humedad en los quesos frescos 120 correspondientes a vida útil y tratamientos experimentales. Grafica N° 11 Evaluación de la acidez titulable en los quesos 120 frescos correspondientes a vida útil y tratamientos experimentales. xi RESUMEN Con el objetivo de determinar el efecto inhibitorio de Lactobacil/us casei ATCC 393 TM sobre el crecimiento de Escherichia coli, se inoculó de manera conjunta al queso fresco experimental tres poblaciones de Lactobacil/us casei ATCC 393™ (103 , 106 y 109 ufc/ml) y a una población de Escherichia coli ATCC 25922™ (103 ufc/ml). Los quesos fueron almacenados a 8 ± 2 oc por 1 O días, realizándose pruebas fisicoquímicas y microbiológicas diariamente. El recuento bacteriano permitió obtener las curvas de crecimiento y los parámetros cinéticos de crecimiento y letalidad de las bacterias experimentales, las cuales fueron ajustadas con el modelo de crecimiento poblacional propuesto por Baranyi y Roberts (Cayré et al, 2007), usando la herramienta predictiva DMFit (Combase, 201 0). Los resultados determinarqn qu~ ~! tratamiento con una población inicial de 109 ufc/ml de Lactobacil/us casei, presentó un efecto bactericida, permitiendo una mayor inhibición y reducción poblacional de Escherichia co/i, mientras que el tratamiento con una población inicial de 106 ufc/ml de Lactobacil/us casei, presentó un efecto bacteriostático, permitiendo el control de la población iniciai de Escherichia coli. Así mismo, la acumulación de bacteriocinas secret~das por el Lactobacil/us casei ATCC 393 TM fue la probable causa de la inhibición del Escherichia coli y no la producción de ácido láctico. La aplicación de Lactobacil/us casei ATCC 393™ en concentraciones· superiores a 106 ufc/ml, permite considerarlo como un bioconservante para quesos frescos, logrando obtener un queso fresco inocuo y extendiendo la vida útil del producto. xii INTRODUCCIÓN La seguridad de los alimentos está relacionada con la protección de la salud de los consumidores, para tal fin se debe garantizar la calidad higiénica de los mismos, controlando todas las etapas de procesos y muchas veces adicionando conservantes que permita la inocuidad durante su vida comercial del producto. Los quesos frescos si bien es cierto de origen ancestral sigue presente en nuestra dieta, siendo en la actualidad los quesos más populares en todos los países latinoamericanos, son los más fáciles de elaborar y uno de mayor rendimiento; sin embargo, también son los de mayor riesgo potencial de intoxicación e infección, debido a que sus características permiten un rápido crecimiento de los microorganismos que alteran el alimentos y generan un riesgo pgra el consumidor, es por ello la preocupación de asegurar la inocuidad del mismo. En la actualidad el uso de las bacterias ácido-lácticas (SAL) en la elaboración de alimentos son ampliamente utilizadas en productos lácteos fermentados. Una de las características de este grupo de bacterias es la producción de ácido láctico desencadenada por el metabolismo microbiano, que aporta texturas y sabores característicos al producto de xiii origen. A demás de la producción de ácido láctico existe la producción de otros metabolitos considerados secundarios como los peróxidos, ácidos orgánicos, diacetilo y bacteriocinas. Esta última presentando actividad antibacteriana. El género Lactobacil/us aporta no solo ácido láctico al alimento si no también bacteriocinas que de acuerdo a la concentración en el producto podría otorgar actividad antimicrobiana del genero gram negativo, responsables del deterioro acelerado del alimento. La aplicación del Lactobacil/us casei en la producción de quesos regula la carga inicial de bacterias presentes en el producto, mejorando la condición sanitaria del queso, permitiendo prolongar el periodo de almacenamiento del producto. En la presente investigación se usó Lactobacil/us casei ATCC 393 TM, quien posee la capacidad de producir bacteriocinas, como principal producto antibacteriano. La presencia de este antibacteriano inhibe y controla el crecimiento del Escherichia co/i ATCC 25922™ presente en el queso, garantizando la inocuidad del. producto. CAPITULO 1 PROBLEMA 1.1 FORMULACIÓN Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA 1 El queso fresco, es uno de los productos lácteos de mayor consumo popular, aceptado no solo por ser fuente de proteínas y calcio, sino también por su variedad de usos, principalmente el culinario. Muchos de los quesos frescos comercializados en el país y en especial los de producción artesanal, son puestos a la venta en expendios ambulatorios, mercados, etc., los cuales presentan elevada carga microbiana, que refleja las deficiencias higiénicas en la manipulación y conservación del producto, representando un riesgo para la salud del consumidor (Cristóbal y Maurtua, 2003). La elevada carga bacteriana presentes en el queso fresco, se debe principalmente a que éste, es un alimento que otorga la condiciones adecuadas para el crecimiento acelerado de cualquier tipo de bacteria que· llegue al pro~ucto durante o después de su elaboración, constituyendo un excelente sustrato para la proliferación de microorganismos como: Salmonella sp., Listeria 'sp., Staphylococcus 2 aureus, Escherichia co/i, entre otros. La presencia de estas bacterias en el alimento, son las causantes de muchas intoxicaciones alimentarias, causadas ya sea por microorganismos patógenos o por las toxinas que estos producen. Debido a su alto contenido de nutrientes, alta actividad de agua (0.99), pH ligeramente ácido (5.6-6.3), favorecen el crecimiento de bacterias iníciales o añadidas post-elaboración. Si bien la sal utilizada para contribuir sensoriamente con el producto, podría inhibir el crecimiento de las bacterias presentes, la concentración de sal permitida en el queso no es la suficiente para ejercer un efecto inhibitorio considerable. Todas estas características del producto, hacen de él un producto perecedero, fuente y vehículo de bacterias patógenas, entre las que se encuentra Escherichia co/i, que indica un riesgo alimentario. La presencia de este patógeno en el queso puede reducirse considerablemente mediante una adecuada higiene y buenas prácticas de manufactura, considerando la aplicación de la pasteurización previa de la leche (jestinada a la elaboración del queso. El uso de conservantes de origen ql!ímico como propionatos y sorbatos, también representa una alternativa para impedir el crecimiento de no solo bacterias, sino también de hongos quienes podrían presentar un riesgo para el consumidor. No obstante la tendencia actual, es la búsqueda de alimentos libres de conservantes químicos; lo cual nos obliga a evaluar nuevos métodos de conservación, entre las que se incruyén el uso de 3 bacterias benéficas con propiedades inhibitorias de bacterias patógenas. Es así que la aplicación de bacterias ácido lácticas como el Lactobaci/lus casei al queso, favorecen a las características sensoriales del producto y también podrían contribuir con su conservación. Esta acción conservante se explica por la producción de ácidos orgánicos, peróxido de hidrogeno y bacteriocinas, este último considerado como un poderoso agente antimicrobiano, que permitiría inhibir el crecimiento de bacterias patógenas y deteriorativas presentes en el queso fresco (Ramírez et al, 2005). La presente investigación propone el uso del Lactobaci/lus casei ATCC 393 ™, debido a que se considera que este microorganismo posee cualidades probióticas por la producción de bacteriocinas como uno de sus principales productos antibacterianos. Debido a esta característica es justificable incorporar al Lactobaci/lus casei ATCC 393™ como un conservante natural al queso fresco, para lograr inhibir el crecimiento de bacterias patógenas a nivel inte.stinal y que permitirá comercializar un producto inocuo. Finalmente, el problema fue planteado bajo la siguiente interrogante: ¿Es factible utilizar Lactobaci/lus casei ATCC 393 TM para controlar o inhibir el crecimiento del Escherichia co/i, y que permita garantizar un producto inocuo durante la vida comercial del queso fresco? 4 1.2 IMPORTANCIA El presente estudio permitirá obtener información básica del uso del Lactobacil/us casei ATCC 393 TM, como una alternativa de conservante de origen natural para inhibir el crecimiento de Escherichia coli, y así permitirá garantizar la inocuidad del queso fresco, prolongando su tiempo de vida útil, ofreciendo beneficios económicos a los productores de queso fresco, ya que se extendería la vida útil del producto, y con ello mayor tiempo de comercialización y consumo del mismo. También permitirá reducir los ·casos clínicos y los costos de tratamientos de enfermedades reportadas por el consumo de este alimento contaminado con Escherichia co/i, causante de cuadros diarreicos a nivel infantil. Además, el presente estudio permitirá obtener evidencia científica que servirá como base para futuras investigaciones, aplicadas· al uso de esta bacteria en el campo de la conservación de otros productos lácteos. 1.3 JUSTIFICACIÓN La presente investigación estudiará el efecto inhibitorio del Lactobacil/us casei ATCC 393™ sobre el crecimiento de Escherichia coli, que permitirá considerarlo como un conservante ·natural y permita reducir las 5 incidencias por infecciones producto del consumo de quesos contaminados con esta bacteria, reduciendo así el uso de conservantes de origen químico como los sorbatos y propionatos. Por otro lado, los resultados obtenidos generaran aporte científico y tecnológico para que el Lactobacil/us casei ATCC 393™ pueda ser incluido dentro de las normas sanitarias del país, que contribuyan a comercializar productos inocuos. Cumpliendo con lo especificado en la NTP 202.195 (2004 ). CAPITULO 11 OBJETIVOS La ejecución del presente proyecto tiene los siguientes objetivos: 2.1 OBJETIVO GENERAL 6 Utilizar el Lactobacillus casei ATCC 393 TM para controlar el crecimiento del Escherichia coli ATCC 25922™ presente en el queso fresco experimental. 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS • Determinar mediante ensayos microbiológicos y fisicoquímicos, la vida comercial del queso fresco experimental elaborado con técnicas artesanales. • Utilizar Lactobacil/us casei ATCC 393 TM a una concentración de 103 ufc/ml para controlar el crecimiento de Escherichia coli en el queso fresco experimental. 7 • Utilizar Lactobacillus casei ATCC 393 TM a una concentración de 106 ufc/ml para controlar el crecimiento de Escherichia coli en el queso fresco experimental. • Utilizar Lactobacillus casei ATCC 393 ™ a una concentración de 1 09 ufc/ml para controlar el crecimiento de Escherichia co/i en el queso fresco experimental. 2.3 ALCANCES DE LA INVESTIGACIÓN La presente investigación determinará la actividad antimicrobiana de Lactobacil/us casei ATCC 393 TM para inhibir o controlar el crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922™. En respuesta a los efectos de Lactobacil/us casei ATCC 393 ™ permitirá garantizar la inocuidad del producto para el consumidor. CAPITULO 111 MARCO TEÓRICO 3.1 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACION 8 Cristóbal y Maurtua (2003), evaluaron la calidad bacteriológica de quesos frescos artesanales comercializados a nivel ambulatorio en el distrito de Pueblo libre, cuya temperatura de almacenamiento estuvo entre 14-22 °C; se evaluó la carga microbiana de bacterias aerobias mesófilas, coliformes totales y fecales, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis y Lactobacil/us spp., y la supuesta acción bactericida de esta última bacteria sobre las anteriores. Lqs resultados indicaron que el 97,4% de las muestras estuvieron por encima de los valores máximos permitidos por la NTP 202.087 (1982)1 para los diferentes microorganismos: coliformes totales (7 4,2% de las muestras), coliformes fecales (58,6%), Escherichia coli (28, 1 %) y Staphylococcus aureus (87,2%). No se observó que la presencia de Lactobacil/us spp. impidiera el crecimiento de los microorganismos estudiados en los quesos. 1 NTP vigente en el año del estudio, posteriormente fue reemplaza por la NTP 202.195 (2004). 9 Cristóbal (2008), aisló 341 cepas identificadas como lactobacilos de quesos artesanales provenientes de lima y provincias. Las especies de lactobacilos aisladas con mayor frecuencia fueron Lactobacil/us casei 56 % y Lactobacillus plantarum 35.8 %. Sólo el 16.42 % de los aislados presentaron actividad inhibitoria frente a Lactobacillus acidophi/us ATCC 4356. Los sobrenadantes de los cultivos bacteriocinogénicos se ajustaron el pH a 6.5 con NaOH 2.5 N, para descartar que la acción inhibitoria fuera debida a los ácidos orgánicos. Por otro lado, Las bacteriocinas presentes en los sobrenadantes de los diferentes aislados inhibieron el crecimiento de cepas de Baci/lus cereus UA05, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 1 0536, Sa/monella typhimurium ATCC 14028, Salmonella choleraesuis ATCC 10708, Shigel/a sonnei ATCC 9290 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Sin embargo, Liste ría innocua UP01 fue resistente. Francia y Santa Cruz (2002), aisl?tron cepas nativas ácido lácticas, proveniente de quesos frescos adquiridos de mercados y puestos de expendio ambulatorio de Lambayeqlje. Evaluaron la actividad inhibitoria de cepas productoras de bacteriocinas a través de la inhibición del crecimiento de Usteria spp., utilizada como cepa indicadora. Se identificaron 44 cepas de Lactqbacil/us, de las· cuales 20 se reconocieron como Lactobacil/us plantarum y 24 Lactobacillus casei, 12 cepas fueron identificadas como Pediococcus spp. y 25 como Lactococcus spp., de las 10 cuales el 90% de Lactobacillus plantarum y 50% Lactobacif/us casei inhibieron el crecimiento de Listeria spp. Gutiérrez, et al (2007), evaluaron la viabilidad de una bacteria ácido láctica nativa con actividad probiótica en un queso crema durante 15 días. Sus resultados indicaron que el queso crema ofrece una serie de ventajas con respecto a las leches fermentadas como vehículo de microorganismos probióticos: el. pH, mayor consistencia, contenido graso y capacidad tamponante, estos factores contribuyeron a la protección de los microorganismos probióticos durante su almacenamiento. Larrea, et al (2007), determinaron el efecto bacteriostático y bactericida del Lactobacil/us casei frente a Escherichia co/i, a través de la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericid? (CMB) de la suspensión de esta cepa en condiciones de laboratorio, encof!trado que para obtener un efecto bacteriostático del Lactobacil/us casei sobre el Escherichia coli se necesita un CMI de 64 ¡JL!ml, mlentras que para obtener un efecto ·'.· bactericida se necesitó un CMB de ?56 ¡JL/ml capaz de lograr una lisis celular y una reducción del 99.99% de la población inicial. López Díaz (2006), estudió diferentes sistemas de calentamiento para pasteurizar leche destinada a la fabricación de queso colonial 11 (pasteurización lenta en el propio tanque de elaboración, con sistemas de calentamiento por hornallas, eléctrico, y con calentamiento por circulación de agua caliente), determinando la eficiencia de éstos en el control de la flora microbiana de la leche cruda. Como resultado de la pasteurización lenta de la leche en tanque abierto (65 °C/30 min), se redujo la población de Escherichia coli de 105 ufc/ml a 10° ufc/ml, permitiendo obtener quesos colonial con padrones microbiológicos dentro de las normas. Así mismo la calidad microbiológica de quesos Colonial fabricados con leche cruda demostró que el 100% de los quesos elaborados eran impropios para el consumo. López Orozco (2004 ), determinó un proceso estandarizado para mejorar la vida en anaquel del queso tradicional ranchero (México). La aplicación de tratamiento térmico previo de la leche, uso de aditivos antimicrobianos, almacenamientq en refrigeración (4-6 °C), la aplicación de programas de limpieza y saneamiento de equipos, le permitieron mejorar la vida en anaquel del producto de 1 O a 15 días. Así mismo, reporto que la humedad de este tipo de quesos se encuentra entre 46-57 % y un pH mayor o igual a 6.1. Márquez y García (2007), evaluaron el efecto inhibitorio de dos concentraciones de nisina (10,0 y 16,7 mg/kg) sobre la población de Staphylococcus aureus, coliformes totales, Escherichia coli, Salmonella 12 sp. y Listeria monocytogenes en queso blanco tipo "telita" elaborado en una quesería de Upata, Venezuela. Se encontró que las dos concentraciones de nisina adicionadas al queso "telita" ejercieron un efecto inhibitorio sobre la población de S. aureus presente como microflora contaminante en las mismas. No se detectó Salmonella spp., ni Listeria monocytogenes en ninguna de las muestras analizadas. Los recuentos de coliformes totales y de E. coli (serotipos 0118 y 08) encontrados en las muestras de queso "telita" sin nisina no mostraron variación al compararlos con los encontrados en las muestras de queso "telita" suplementadas con las dos concentraciones de nisina ensayadas, debido al espectro antimicrobiano de la nisina. Mejía, et al (2007), evaluó el efecto inhibitorio de 2 concentraciones de sobrenadantes de cultivos de cepas Lactobacil/us sp. aisladas de heces de niños lactantes y muestras Vélginales, sobre el crecimiento de patógenos de prueba como Escheric~ia coli ATCC 25922™, encontró que la exposición de este patógeno al 1 0% de sobrenadante de cepas Lactobacil/us spp., permitió obtener un efecto bacteriostático, logrando controlar el crecimiento de este patógeno por 8 horas y que la exposición a una concentración de 50% de sobrenadante permite no solo la inhibición si no la reducción poblacional, logrando un efecto bactericida. En el mismo estudio se descartó que el efecto inhibitorio de las cepas Lactobacil/us spp. se debía a la producción de ácidos orgánicos, mediante 13 la exposición de los microorganismos patógenos de prueba al crecimiento en un medio con una máxima concentración de ácido láctico (0.25%), encontrando que el crecimiento de bacterias patógenas se vieron afectadas pero no en la magnitud que se produjo en presencia del sobrenadante del cultivo de Lactobacil/us, además en ninguno de los casos se observo lisis celular. Ramírez, et al (2005), evaluaron la presencia y la actividad antimicrobiana de las bacterias ácido-lácticas (BAL) productoras de bacteriocinas aisladas de quesos artesanales del estado de Hidalgo en México. El espectro de actividad de estas cepas fue evaluado tanto frente a bacterias Gram positivas como contra Gram negativas. De acuerdo a los resultados, Vibrio cholerae fue el microorganismo más sensible, ya que el 26.06 % de las cepas de BAL analizadas lo inhibieron. Por el contrario, se observó cepas resistentes como Escherichia co/i, Citrobacter, Proteus y Bacil/us, en las cuales menos del 1 % de las BAL tuvieron un efecto inhibitorio. Así mismo, cabe señalar la inhibición de Listeria monocytogenes que si bien fue inhibida solo por el 2.42 % de las cepas de BAL, el grado de inhibición mostrado frente a las cepas a las que resultó sensible es considerable (halos entre 4 y 7 mm). Zambra no (201 0), determinó la viabilidad de un queso probiótico usando Lactobacil/us acidophilus. Evaluó en el producto características físicas, 14 químicas, microbiológicas y organolépticas. Así mismo, realizó un análisis de estabilidad del producto considerando la variación de peso, pH, sinéresis y contaminación microbiana, medidos los días 1, 7, 14 y 21. Determinó, que el queso fresco es un vehículo ideal para Lactobacil/us acidophilus pues las colonias se mantuvieron viables y sobre los niveles mínimos recomendables para considerar al producto como probiótico, entre 106 y 107 UFC/g. El uso de los microorganismos en la fabricación del queso fresco no influyó e~ la humedad de los quesos, reportándose una humedad promedio de 64.16%, pero si modificó algunas características como la acidez y pH durante su periodo de vida útil (21 días almacenado a 4-10 °C). 3.2 REVISION LITERARIA 3.2.1 LECHE 3.2.1.1 Definición La leche es la materia prima principal para la elaboración de quesos. La leche según la definición legal NTP 202.001, es el producto de la ordeña completa y no interrumpida de vacas sanas bien alimentadas, en reposo y exenta de calostro, la cual qebe de poseer n9 menos de 3.0% de materia 15 grasa y no menos de 8.20% de sólidos no grasos. Otra característica de la leche fresca, es que debe de estar libre de antibióticos, olores, materias o sabores extraños. Así mismo, la acidez de la leche destinada a la elaboración quesos debe encontrarse en el rango de 0.14- 0.18 g Ác. Láctico/100 leche y el pH de 6.5-6.8 (Zambrano, 2010) Para Schlimme y Buchheim (2002), la leche es una secreción blanca producto del ordeño de una o varias vacas, la cual se puede describir como un sistema polidisperso donde la grasa se encuentra emulsionada en forma de gotitas alrededor de una membrana, las proteínas se encuentran dispersas y formando un coloide en forma de micelas y la lactosa es el carbohidrato principal y se encuentra disuelto. 3.2.1.2 Composición química de la leche La leche es un alimento adaptado para los recién nacidos de cada especie que contiene en una forma fácilmente absorbible, todos los nutrientes y agentes activos que el recién nacido necesita para el crecimiento y el mantenimiento corporal. La composición de la leche varía dentro de una misma especie, estas variaciones están determinadas por la raza, la edad, el estadio de lactación, la alimentación, el manejo así como por el estado sanitario (Schlimme y Buchheim, 2002). Por lo tanto es difícil dar una composición exacta de la leche de una especie animal. 16 Las variaciones de la composición de la leche cruda de vaca se muestra en la Tabla N°1. Tabla N°1 Composición media de la leche cruda de algunas razas vacunas (%p/p) Holstein Jersey Parda suiza Alemana Agua 87.0 85.4 87.1 Grasa 4.2 5.3 .· 3.9 Proteína 3.4 3.9 3.5 Lactosa 4.7 4.7 4.6 Cenizas 0.75 0.75 0.75 Fuente: Schlimme y Buchheim, 2002 3.2.1.2.1 Grasa La grasa de la leche está compuesta sobre todo por grasas neutras (triglicéridos) con algunos lipoides (fosfolipídos, carotenoides, tocoferoles, aldehídos, etc.), que aunque en pequeñas proporciones, tienen una gran ' ' ·' influencia en la elaboración del queso, ya que contribuye a su aroma y color (Madrid, 1996). 3.2.1.2.2 Proteínas Están formadas por polímeros de a-aminoácidos, además pueden contener otros compuestos. Su estructura básica son aminoácidos unidos 17 por un enlace peptídico entre cada grupo amino y carboxilo. Las proteínas participan en un gran grupo de reacciones químicas tales como oxidación, reducción, hidrólisis y desaminación entre otras (Revilla, 1982). Según la Figura N° 1, si se toma en cuenta las cantidades de diferentes proteínas en la leche, indiscutiblemente la caseína se encuentra en primer lugar, ya que constituye el 80 % de las proteínas lácticas. Además, la caseína es la que da el color a la leche y juega un papel muy importante en la elaboración de quesos gracias a su coagulación (se precipita fácilmente en medios ácidos), para constituir al final del proceso cerca del 25 % del queso terminado (Artavia, 1999). Además se observa que el suero posee 1 % de proteína, lo que se puede comparar con el 3.4 % de proteína de la leche (Schlimme y Buchheim, 2002). Figura N°1 Distribución de la proteínas de la Leche de vaca PROTEINAS l , \, 80% insolubl~s en H20 {Casef~a) 15-20% Solubles en H20 (lactoglubulinas) Fuente: Adaptada de Artavia, 1999. 25% Queso 1% Suero 18 3.2.1.2.3 Carbohidratos Prácticamente la lactosa es el único azúcar de la leche, aunque en ella existan poliósidos libres y glúcidos combinados en pequeñas proporción (Madrid, 1996). La lactosa constituye la mitad de los sólidos no grasos y cerca de un 4.7 % del total de la leche. Además, la propiedad más importante de la lactosa que esta puede ser transformada en acido láctico por acción de las bacterias acido lácticas, siendo este el principal factor de maduración y fermentación de los productos lácteos. También juega un papel importante en el control microbiano cuando este se encuentra en altas concentraciones en el alimento. 3.2.1.2.4 Sales minerales Las sales minerales en la leche se encuentran disueltas o formando compuestos con la caseína. Las rnás numerosas son calcio, ·potasio, sodio y magnesio, que se encuentran como fosfato cálcico, cloruro sódico, caseinato cálcico, etc. El calcio se encuentra en dos formas en la leche. El 30% aproximadamente en solución y el restante 70% en forma coloidal. El fosfato cálcico forma parte del complejo caseínico producido en la coagulación de la leche al fabricar quesos, contribuyendo al aumento del tamaño de las micelas de caseína (Madrid, 1 996). 19 3.2.1.2.5 Vitaminas La leche es rica en vitaminas, las cuales nos ayudan a una mejor asimilación de los nutrientes. Las vitaminas más comunes en la leche son las solubles en grasa (A y D) y las solubles en agua (vitamina C y el complejo vitamínico B). Es por esta razón que los quesos son ricos en vitaminas A, D y algunas del complejo 8 como las vitaminas 81 y 82 (Madrid, 1996). 3.2.2 QUESO FRESCO 3.2.2.1 Características generales En el Perú, el consumo de Queso Fresco, se ha incrementado, llegando al 75% en relación al consumo de quesos madurados; esto debido a su bajo costo, a sus características nutric;iongles y usos variados (Calle y Solano, 2004). Según la definición legal NTP 202.195, define al queso fresco 1 (tradicional), como el queso blando, no madurado ni escaldado, moldeado, de textura relativamente firme, levemente granular, sin cultivos lácteos, obtenido por separación del suero después de la coagulación de 20 la leche pasteurizada, entera, descremada o parcialmente descremada, o una mezcla de algunos de estos productos. Los quesos frescos tienen un alto contenido de humedad y no han sufrido proceso de maduración, por lo que pueden tener sabor a leche fresca o leche acidificada. Su consistencia suele ser pastosa y su color blanco. Por tener un alto contenido de humedad en la pasta (45-80%), su tiempo de vida útil resulta corto, debiendo ser consumidos en pocos días. Su transporte y conservación se debe hacer a temperaturas de 4-1 O °C; aun manteniendo la cadena de fria son altamente perecederos (Madrid, 1996; Villegas, 2009). Los quesos frescos deben presentar una humedad mayor al 46 % y su contenido de materia grasa en extracto seco mayor al 40 %. Microbiológicamente debe cumplir con las características presentadas en la Tabla 2. Los quesos se encuentran entre los mejores alimentos del hombre siendo una variedad ampliamente producida en los países de Latinoamérica por la sencillez del procesamiento, su costo .más bajo y el rendimiento mayor al obtenido en comparación con otras variedades (Inda, 2000). El queso fresco es un alimento reconocido por su alto valor nutricional debido a sus 21 altas concentraciones de proteínas, calcio, rivoflavina y vitaminas A y O (Dillon y Berthier, citado por Cerón 2008). Tabla N° 2 Requisitos Microbiológicos para el Queso fresco Requisito Numeración de coliformes Numeración de Staphylococcus coagulosa positiva Detección Salmonel/a sp. Detección Listeria monocytogenes Fuente: NTP 202.195 (2004) Conteo Máximo (ufc/g) Ausencia en 25 g Ausencia en 25 g Tabla N° 3 Composición química del queso fresco Agua Grasa Proteína Carbohidratos Porcentaje (%) 45-65 17-26 15-25 2-3.5 Sales Minerales 2 - 4.5 Fuente: Adaptada de Calle y Solano 2004; Cerón 2008 y Collazos 1996. 22 3.2.2.2 Alteración del queso fresco Por su alto contenido proteico, el queso fresco se constituye en el sustrato adecuado para el crecimiento bacteriano. Las características del queso fresco (pH, humedad y nutrientes) permiten el desarrollo de muchos microorganismos propios de la leche, de contaminación ambiental y del manipuleo del producto terminado y/o durante la producción del mismo. La flora microbiana varía con los distintos tipos de quesos e inclusive entre varios quesos del mismo tipo, dependiendo siempre de la carga microbiana inicial de la leche y la eficiencia de la pasteurización. Entre los microorganismos que pueden generar un riesgo para el consumidor y que puede presentar el queso fresco son: Coliformes, Escherichia coli, hongos y levaduras, Staphylococcus aureus, Sa/monel/a sp., Lactobacil/us sp. y Listeria monocytogenes. La velocidad de deterioro o alteraciqn del queso no solo depende de los microorganismos presentes, sino también de la composición química del alimento y del tipo de carga inicial. Algunos factores relacionados que afectan al crecimiento de las bacterias causantes del deterioro del queso fresco son: la actividad de agua presente en el alimento, pH y ligera acidez del alimento que favorecen el crecimiento bacteriano, el tratamiento térmico aplicado a la leche previo al procesamiento del queso, 23 las condiciones ambientales en la cual se conserva el queso (temperatura y humedad), y finalmente la relación de dependencia entre los microorganismos presentes en el queso (antagonismo o sinergismo). La alteración de los quesos es principalmente de dos tipos, el crecimiento superficial de microorganismos, normalmente mohos, y la producción de gas, alteración del sabor y aroma, debida al crecimiento de microorganismos en el interior de la masa del queso. Los quesos muy ácidos se alteran normalmente por acción de levaduras y mohos, pero la alteración bacteriana es importante en las variedades de pH más alto, como el queso fresco blanco o el queso cottage. Las bacterias más comunes son gram negativas, como las Pseudomonas y enterobacterias, aunque también Enterococcus puede producir alteración. En cuanto al crecimiento de mohos produce una alteración visible, muchas veces acompañada de una lipólisis y proteólisis intensa, siendo los responsables más frecuentes de esta alteración los Penicilfium en un 60-80% de los casos y Aspergillus (Varnam y Sutherland, 1994). 3.2.2.3 Conservantes en queso fresco En la actualidad el uso de conservantes de origen químico en los procesos de elaboración de alimentos se realiza con el afán de prolongar su tiempo de vida comercial. Los sorbatos y propionatos son los 24 conservantes más comunes incluidos en las formulaciones de alimentos. La elaboración del queso fresco no está ajena al uso de estos conservantes que permite extender su vida en anaquel. Los conservantes permitidos para su uso en alimentos está regulado por disposiciones legales nacionales e internacionales, tal es el caso que la FDA!Codex Alimentarius tiene permitido la aplicación de ciertos aditivos en la elaboración del queso fresco (Tabla N° 4 ). Tabla N° 4 Conservantes permitidos para quesos no madurados NOMBRE DEL ADITIVO Ácido sórbico Sorbato de potasio Sorbato de calcio NISINA Ácido propiónico Propionato de sodio Propionato de calcio Propionato de potasio DOSIS MAXIMA 1 g/Kg de queso, sólo o lll§:Z:Ciado, expresado como ácido · · · · ascórbico 12,5 mg/Kg Limitada por las BPF Fuente: FDA/Codex Alimentarius. Codex Stan 221, 2001. La alteración del queso por mohos se suele retardar o impedir cuando al propio queso o a los materiales que se emplean para envolverlos se les 25 añade ácido sórbico, sorbatos, ácido propiónico o propionatos. Aunque son más eficaces a valores bajos de pH, siendo empleados en alimentos cuyo pH tiene un valor próximo a 6.5 (Frazier y Westhoff, 2000). El uso de conservantes químicos como el Sorbato de potasio, que si bien se usa fundamentalmente para prevenir las alteraciones provocadas por mohos en la superficie del queso, también tiene efecto inhibidor sobre un gran número de bacterias (Franco et al, 2002). Para López Orozco (2004 ), el Sorbato de potasio es el aditivo antifúngico más apropiado en base a su funcionalidad y a su costo, para su uso en quesos frescos con pH entre 5.0 y 6.0. 3.2.2.4 Elaboración de queso fresco Las operaciones que se aplican para la obtención del queso generalmente involucran la acidificación y deshiqratación de la leche en la cual se concentra la grasa y la caseína de la leche por la coagulación enzimática (quimosina) de la caseína. En la elaboración de los diferentes tipos de quesos, existen diferentes pasos a seguir, siendo la adición del cuajo una de las etapas más importantes. 26 4.2.2.4.1 Insumes a. Leche La leche es la materia prima principal en la elaboración del queso fresco, es fuente importante de lactosa y caseína. La caseína ocupa el 80% aproximadamente de la fracción nitrogenada de la leche, siendo fundamental para la elaboración de quesos, pues .sobre ella actúan los coagulantes. b. Cuajo El cuajo es una enzima especifica llamada quimosina, la cual es secretada en el abomaso (cuarto estomago) de los rumiantes y tradicionalmente la principal fuente de suministro son los terneros (Varnam y Sutherland, 1994). Frecuentemente utilizada en la fabricación de queso cuya función es separar el agua de la leche, llamado suero, de la cuajada, a partir de la cual se fabrican los quesos. El accionar de la quimosina es que actúa directame[lte en un punto delimitado de la caseína. Al romper dicha molécula se inicia la formación de un gel que atrapa la mayoría de los componentes sólidos de la leche; este gel se contrae poco a poco y al contraerse va expulsando suero. Al cortarse el 27 gel en cubitos, se logra separar entre un 50-90 % del contenido inicial del agua de la leche. c. Sal común El cloruro de sodio (NaCI), comúnmente llamado sal, cumple un rol importante en la elaboración de quesos. La sal da forma y constriñe las características del queso. La sal tiene influencia en el desuerado, el cual a su vez incide en el contenido de humedad del queso terminado. Al mismo tiempo, la sal afecta la forma y características de la corteza del queso, influye en e! sabor así como en el desarrollo y supervivencia de bacterias iniciadoras o no iniciadoras (Jonson y Paulus, 2005). d. Cloruro de Calcio El cloruro de calcio (CaCh), tiene como función darle mayor firmeza mecánica a la cuajadR Esto es particularmente importante cuando ·se trata de leche pasteurizada, porque durante la pasteurización, se da un proceso normal de descalcificación parcial de las caseínas. La ausencia de cloruro de calcio hace que muqhas veces la cuajada tenga poca firmeza mecánica y, entonces, al cortarla, se generarán cantidades innecesarias de "polvo" o "finos" de cuajada, que se depositan en el fondo de la tina de quesería y se van con el lactosuero, en lugar de contribuir al rendimiento del queso (Inda, 2000). 28 4.2.2.4.2 Etapas de la elaboración de queso fresco a. Recepción de la Leche La leche empleada en la elaboración de quesos debe ser de buena calidad, tanto de vista químico como microbiológico, incluso los niveles de higiene exigidos para la leche de consumo directo, deben ser exigidos para la leche destinada a la elaboración de quesos (Madrid, 1996). La leche debe de tener la acidez requerida y debe estar libre de impurezas, siendo necesaria su filtración para eliminar cuerpos extraños en la misma. Es importante aplicar en la leche una serie de pruebas y procedimientos para comprobar el estado de conservación de la leche que ingresa a proceso e involucran la determinación de pH, la acidez titulable y la estabilidad frente al alcohol. b. Pasteurizado La pasteurización puede definirse como "un proceso higienizante destinado a eliminar completamente la· microflora patógena de la leche, disminuir considerablemente la microflora banal y destruir un alto porcentaje de enzimas deterioradoras (Villegas, 2009). No obstante, el calentamiento de la leche origina la pérdida de su capacidad de coagulación por el cuajo. Sin embargo, tecnológicamente está perdida 29 puede ser reversible mediante la adición de CaCb (Varnam y Sutherland, 1994). La pasteurización es un procedimiento fundamental en la elaboración de quesos frescos de corta maduración y en los curados de no más de 2 meses (Martegani, 2006). Para quesos frescos existen dos métodos para pasteurizar la leche; el primero consiste en calentar la leche a 63-65 °C, durante 30 minutos (pasteurización lenta, L TL T) y el otro en calentarla durante 15 segundos, a 72 oc (pasteurización rápida, HTST). Ambos tratamientos son equivalentes en cuanto a su capacidad de destrucción total de microorganismos patógenos (Inda, 2000; Villegas, 2009; López Orozco, 2004). Para Frazier y Westhoff (2000), la pasteurización lenta de la leche a 65 oc por 30 minutos es eficiente en la eliminación de la flora patógena inicial de la leche, permitiendo la reducción del 99.9% de la carga inicial. c. Enfriado El objetivo principal de esta etapa es acondicionar la leche (Temperatura, corrección de calcio) que permita mejorar el rendimiento, la actividad y formación del cuajo. Con la pasteurización la leche se pierde algunas de sus propiedades coagulantes; pierde entre 8 y 30% de calcio soluble, dando coágulos más débiles y difíciles de desuerar, provocando pérdidas 30 por los tratamientos mecánicos a aplicar (Zambra no, 201 0). El uso de cloruro de calcio restituye parte de este calcio, pudiéndose agregar en esta etapa el CaCb en una proporción no mayor del 0.02 % en relación a la leche que entró a proceso (Fernández et al, 2004 ). Con la adición del cloruro de calcio facilitamos la coagulación, mejora el rendimiento y en definitiva la calidad final del queso. d. Coagulado La coagulación de la caseína es el proceso fundamental de la fabricación del queso, y es consecuencia de la desestabilización proteica y puede llevarse a cabo mediante la acción de proteínasas ácidas como la quimosina (coagulación enzimática) o por acidificación a un valor de pH próximo al punto isoeléctrico de las proteínas (Varnam y Sutherland, 1994; Zambrano, 201 0). La coagulación enzimática tiene lugar en dos fases distintas, una fase proteolítica en la que las micelas de caseína se desestabilizan por hidrólisis de la k-cªseína, formándose micelas de para­ k-caseína y una fase secundaria, mediada por el calcio, en la que las micelas de paracaseína se agregan y precipitan. Con el tiempo van formando Una red con poros, dentro de la cual se van acomodando los glóbulos grasos y el coágulo se va haciendo más firme por la continua formación de enlaces entre las micelas (Zambrano, 2010). Esta última fase requiere condiciones de reposo y una temperatura por encima de 20 31 oc (Varnam y Sutherland, 1994). Para Zambrano (2010), la temperatura óptima de acción del cuajo está alrededor de los 40°C pero se utiliza menores para evitar la dureza del coagulo e. Cortado y Batido El corte de la cuaja inicial favorece la sinéresis. Durante el corte debe evitarse la ruptura del coagulo y la correspondiente pérdida de materia grasa y un deficiente sinéresis (Varnam y Sutherland, 1994). El tamaño del corte de la cuajada depende del tipo de queso y permitirá obtener un queso más o menos húmedo. Para los quesos frescos se debe cortar en cubos de 1 a 2 cm de arista, en lo posible de forma homogénea que permita la salida de la mayor cantidad de suero posible por aumento de la superficie (Zambrano, 201 0). La agitación o batido de la cuajada, manteniendo la temperatura entre 38-40 °C, favorece a la sinéresis y la eliminación del suero. f. Desuerado Consiste en la separación del suero de la cuajada, ya sea por filtración o decantación. Pudiéndose separar hasta el 90% del lactosuero. Tecnológicamente se puede realizar dos desuerados, en el primer desuerado se elimina el 35-50% del lactosuero, el suero restante permite 32 la homogenización de la sal añadida de manera directa. El suero generalmente puede ser aprovechado para la elaboración de otros productos. g. Salado El salado es un procedimiento que se aplica en todo tipo de quesos. El salado debe realizarse para lograr el sabor adecuado del queso, además facilita el desuerado de la cuajada y tiene un papel conservante al inhibir el crecimiento de bacterias no deseables, cuando este se encuentra en concentraciones elevadas. h. Moldeado El moldeado permite que los coágulos se unan y formen una masa continua, determinando así la textura del queso y la forma definitiva (Zambrano, 2010). Los orificios del molde permiten la salida del suero retenido en el interior de la cuajada. i. Almacenado La refrigeración permite que ¡:¡1 queso alcance su punto final de textura y presentación. El almacenamiento en refrigeración se debe realizar a una 33 temperatura de 4 - 7 o C, para impedir el crecimiento acelerado de los microorganismos, sin afectar a las características sensoriales del producto (IIAC, 2004). La durabilidad del queso fresco es variable y depende de que tan riguroso se fuera con la elaboración, sobre todo en la pasteurización, enfriamiento de la leche, manipulación de la cuajada durante el moldeado y almacenamiento del producto final (Fundación para la innovación agraria de Chile, 2000). 3.2.3 BACTERIAS ÁCIDO-LÁCTICAS 3.2.3.1 Características generales Las bacterias ácido-lácticas constituyen un grupo de microorganismos de gran importancia en la industria alimentaria, ya que participan fundamentalmente en los procesos de maduración de muchos alimentos fermentados como derivados lácteos, cárnicos e otros. La fermentación de los alimentos por bacterias ácido,lácticas (BAL) es una de las formas más antiguas de conservación usad?S por el hombre. Incluidos en estos alimentos están el yogurt, much~s variedades de quesos, salsas, vegetales fermentados y productos de panadería (Ramírez et al, 2005). 34 Las bacterias lácticas se definen como microorganismos gram positivos, generalmente inmóviles, no esporulados, y no reductores de nitratos. Tampoco licúan la gelatina y no producen indol ni ácido sulfhídrico. Son anaerobios aerotolerantes ya que, aunque en general carecen de catalasa, poseen peroxidasas y superóxidodismutasas que destruyen, respectivamente, el H O y el 0 2 que se forman en condiciones de 2 2 aerobiosis (Martínez, 1996). Este grupo de microorganismos está formado por Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus, cuya característica principal es la producción de ácido láctico. Uno de los rasgos fisiológicos más característicos es su tolerancia al ácido como consecuencia obligada de su metabolismo, lo cual les ofrece una gran ventaja para desarrollarse en los hábitats donde se encuentran. Las actividades metabólicas de las bacterias lácticas no sólo contribuyen al desarrollo de las características organolépticas y reológicas de los alimentos fermentados, además, permiten preservar el valor nutritivo y la salubridad de la materia prima, propqrcionando un producto agradable al consumidor y generando en él Ull ambiente poco favorable para el desarrollo de patógenos y otros microorganismos que pudieran alterarlos (Martínez, 1996). En la actualidad un gran número de BAL son consideradas probióticas ya que estas ejercen una _ acción protectora contra la adherencia, la colonización, la reproducción y la acción patógena de agentes 35 enteropatógenos específicos, mediante distintas mecanismo de acción, que aún no han sido completamente esclarecidos (Amores et al, citado por Cartes, 2005). Las BAL utilizadas generalmente como probióticos pertenecen a especies de los géneros Lactobacil/us, Enterococcus y Bifidobacterium. 3.2.3.2 Efectos protector/inhibitorio de las BAL Los microorganismos poseen distintas formas para sobrevivir y competir en su ambiente, interactuando unas con otras; habiéndose definido dos efectos de interacción: un efecto sinérgico o un efecto antagónico. Un claro ejemplo del efecto sinérgico se da en el cultivo clásico de yogurt donde existe una protosimbiosis entre Streptococcus thermophilus y el Lactobacil/us bulgaricus. Mientr~s que ~1 efecto antagónico se da por la producción de sustancias de defensa que le confieren un carácter antagónico frente al crecimiento de microorganismos patógenos. Este efecto antagónico se basa comúnmynte en la producción de sustancias que inhiben e interactúan más o menos, especialmente con microorganismos iniciadores relaCionados y hasta con bacterias no relacionadas (Heller, 2008). La capacidad de producir grandes cantidades de ácido láctico por fermentación de los carbohidratos presentes y la consecuente caída del pH son los factores primarios en los que se basa la actividad 36 antimicrobiana de las bacterias lácticas. Los ácidos lipofílicos son capaces de atravesar la membrana plasmática e interferir con las funciones básicas del metabolismo celular, disminuyendo el pH interno de la célula. Así se explica el amplio rango de microorganismos inhibidos, con la única excepción de los organismos acidodúricos como levaduras, mohos y las propias bacterias lácticas (Martínez, 1996). Así pues, las BAL llegan a proliferar en la mayoría de los hábitats, constituyendo un claro ejemplo de antagonismo microbiano. Otro efecto antagónico mostrado por las BAL consideradas probióticas, es la competición con los patógenos, no sólo por los nutrientes, sino también por el espacio físico. Algunas de estas bacterias pueden inhibir la adherencia de los agentes patógenos a los sitios receptores de la célula animal por un mecanismo d~ bloqu~o ~?pecífico del receptor, con lo que se produce una prevención de la colonización de los microorganismos patógenos, por inhibición competitiva en los lugares de adhesión (Chauviere et al, citado por Cartes, ?005). En general la privación a los agentes patógenos de los nutrient~s específicos limita el desarrollo y proliferación de los mismos. Sin embargo, el complejo sistema antagonista de las bacterias lácticas no sólo se basa en la producción de ácido láctico sino que también participan activamente otros metabolitos inhibitorios que a pesar de ser sintetizados en menor cantidad, contribuyen significativamente al efecto antagónico. Entre ellos cabe destacar la producción de H202 y otros derivados del metabolismo del 02, 37 C02, compuestos aromáticos (diacetilo, acetaldehido), derivados deshidratados del glicerol (reuterina), benzoato, enzimas bacteriolíticos, bacteriocinas (Rojas y Vargas, 2007; Muños, 2003; Farías et al, citado por Ramírez et al, 2005; Martínez, 1996). La producción de estas sustancias anti-microbianas es considerada como el principal mecanismo por el cual las bacterias lácticas inhiben el crecimiento de diferentes bacterias patógenas, como Escherichia coli, Streptococcus y Sa/monella (Fons et al, citado por Cartes, 2005; González et al, 2003). Tabla N° 5 Principales mecanismos de Acción propuestas para las bacterias probióticas ACCION MECANISMO Bloqueo de receptores específicos Prevención de la colonización por (adherencia) . y competencia por microorganismos patógenos nutrientes. Actividad antimicrobiana lnmunomoduladora Actividad enzimática Fuente: Adaptada de Cartes, 2005 Producción de sustancias con acción antimicrobiana (H202, bacteriocinas, ácidos orgánicos ... ). ·•· R~gulación de la respuesta inmunitaria hymoral y celular. Disminución en la actividad de enzimas asociadas con la síntesis de lactosas, procarcinógenos, etc. 38 3.2.3.3 Características generales del género Lactobacil/us Son organismos gram positivos, inmóviles, no esporulados, microaerófilos, mejorando su crecimiento en anaerobiosis o bajo reducidas presiones de oxígeno y entre 5 y 1 O % de dióxido de carbono. Su temperatura óptima de crecimiento se sitúa entre 30 y 40 oc. Su tolerancia al ácido varía desde 0,3% hasta 1 ,9% de acidez titulable (Gomes y Malcata, citado por Cartes, 2005). El pH óptimo para su crecimiento se ubica entre 5,5 y 6,2, pudiendo desarrollarse a pH menores de 5,0 (Kandler y Weiss, citado por Cartes, 2005). El género Lactobacil/us está distribuido a través del tracto gastrointestinal y genital, constituye una fracción importante de la microflora presente en el hombre. Su repartición es afectada por distintos factores medioambientales, entre los que se incluyen el pH, la disponibilidad de oxígeno, los niveles de sustratos específicos, la presencia de secreciones y las interacciones bacterianas. Es por ello que para que esta cepa sea considerada un organismo probiótico, debe presentar adecuada estabilidad al ácido clorhídrico y a la pilis, que permita su paso por todo el tracto gastrointestinal, para que se §!dhiera a la mucosa intestinal y que colonice temporalmente el tracto gastrointestinal humano, produciendo componentes antimicrobianos. 39 3.2.3.4 Características generales de Lactobacil/us casei Son bacterias gram positivas con forma de bastón inmóviles, las cuales se encuentran en pares o cadenas, son mesófilas heterofermentadoras facultativas, las cuales producen ácido láctico como principal producto final de la fermentación y no producen gas en presencia de glucosa. En condiciones limitadas de glucosa, producen tres otros productos, ácido acético, etanol y ácido fórmico (Navarrete, 2007). Su nombre proviene principalmente de la palabra "Caseus" que significa queso (Curry y Crow, citado por Alvarado, 2008). Cada microorganismo está rodeado de una pared de aproximadamente 20 a 30 nm de grosor, la cual está compuesta de peptidoglicano, ácido teicoico y proteínas. Es una bacteria anaeróbica facultativa, no esporuladas, no productora de catalasa, comúnmente se encuentran en forma natural en vegetales fermentados, leche, carne, así como en el intestino. Genera su energía a partir de la glucosa de acuerdo a la siguiente reacción: El ácido láctico producido, se acumula en el medio, y el pH del medio decrece. Cuando la concentración de ácido láctico incrementa a 16 g/1, el 40 pH decrece cerca de 4, el crecimiento microbiano cesa debido a la alta concentración del ácido láctico (Cerón, 2008). Adicionalmente a la producción del ácido láctico como producto principal, también produce otros metabolitos como las bacteriocinas. Debido a que este microorganismo ejerce beneficios sobre el organismo del consumidor y a la actividad biológica que presenta esta cepa y otras cepas benéficas se les emplea en la elaboración de alimentos lácteos probióticos. Con el término "probiótico", se ha definido a los microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades adecuadas ejercen una influencia positiva en la salud o en la fisiología del hospedero (Schrezenmeir y Vrese, citado por González et al, 2003). Esta cepa probiótica, se ha comprobado que es muy resistente a rangos muy amplios de pH y temperatura, siendo además un complemento al crecimiento del Lactobacil/us acidophilus, un productor de la enzima amilasa (una enzima digestiva de carbohidratos en la saliva y en el jugo pancreático de mamíferos). Se sabe que mejora la digestión, la tolerancia a la leche y evita la diarrea. Por esta razón se emplea en la elaboración de diversos alimentos funcionales. 41 3.2.4 BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR LAS BAL 3.2.4.1 Características generales Las bacteriocinas son sustancias antimicrobianas de naturaleza peptídica producidas por diferentes cepas bacterianas (Ramírez et al, 2005; Monroy et al, 2009). Las bacteriocinas son un grupo heterogéneo de péptidos sintetizados en el ribosoma con más de 60 aminoácidos y pueden ser péptidos de moléculas elongadas o péptidos de moléculas globulares con un amplio rango de peso molecular (Fimland et al, citado por Rojas y Vargas, 2007). Estas sustancias con frecuencia actúan frente a las bacterias más estrechamente relacionadas con la especie productora (Tagg et al, citado por Martínez, 1996). Sin· embargo otros estudios recientes afirman que también pueden ?Ctuar frente a otras especies bacterianas, hongos y algunos parásitos (Monroy et al, 2009; Sablón et al, citado por González et al, 2003). La producción de bacteriocinas parece depender del crecimiento y actividad fisiológica de la cepa productora. De hecho, la mayoría de las bacteriocinas que se han estudiado hasta el momento presentan una cinética de metabolito primario y, en consecuencia, su producción está correlacionada con el aumento de la biomasa (Martínez, 1996). La actividad antibacteriana de .las bacteriocinas producidas por las BAL, se 42 pronuncia en la fase logarítmica temprana y la fase estacionaria por lo que a la hora de aplicar las bacteriocinas a un alimento a partir de un cultivo iniciador o para su purificación, es importante considerar que la etapa en la cual la velocidad máxima de producción de la bacteriocina es la fase log, por lo que aumenta la efectividad del proceso de acción de estos compuestos ante microorganismos alterantes o patógenos importantes (Ogunbanwo et al, Pal et al, citados por Rojas y Vargas, 2007). Las características antagónicas que han presentado las bacteoricinas contra microorganismos patógenos presentes en los alimentos, permite ser considerados en la bioconservación de alimentos, es decir, el uso de bacterias lácticas, sus productos metabólicos o ambos que permitirá mejorar la seguridad y calidad de los alimentos que generalmente no son fermentados, como lo es el queso fresco. En la actualidad las bacteriocinéls producidas por las bacterias lácticas son las que encierran un mayor interés ya que tienen el reconocimiento de GRAS, por su siglas en inglés (General/y recognized as safe), es decir son consideradas como microorganil)mos seguros para la salud, ya que tanto ellas como sus metabolitos han sido consumidos en alimentos fermentados por innumerables generaciones sin que hubiera efectos adversos en la población (son proteínas que al biodegradarse nb forman 43 compuestos secundarios). Además tiene un papel importante en la preservación y fermentación de alimentos, además de mejorar la calidad higiénica en alimentos por inhibir la flora competitiva la cual incluye bacterias deteriorativas y patógenas como Listeria monocytogenes (Rojas y Vargas, 2007; Monroy et al, 2009; González et al, 2003). De acuerdo al espectro de inhibición, existen bacteoricinas que son activas frente a cepas o especies relacionadas como la lactococinas A, B, M y G, lactacina B, helveticina J, etc. Pero también existen bacteoricinas que inhiben a un rango mucho más amplio de microorganismos, entre los que se incluyen patógenos y alterantes de alimentos Gram positivos nisina, pediocinas, lactacina F, etc (Kiaenhammer, citado por Martínez, 1996). Considerando la diferencia en peso molecular se entiende que cada bacteriocina es diferente y que su uso en la industria alimentaria como preservante, depende del microorganismo de deterioro o patógeno que se desea controlar (Rojas y Vargas, 2007). El estudio de las propiedades físiQas y químicas, modo de acción y relaciones entre estructura y función de las bacteriocinas es necesario para evaluar su potencial aplicacione§ en alimentos (Núñez et al, 2007). 44 3.2.4.2 Modo de acción de las Bacteriocinas El blanco primario de acción de las bacteriocinas parece ser la membrana plasmática. Éstas alteran la permeabilidad selectiva de la membrana de las células vegetativas sensibles, provocando la inmediata e inespecífica liberación de iones, compuestos de bajo peso molecular y algo más tarde del ATP intracelular. Estas alteraciones provocan la disipación completa o parcial de la fuerza protón motriz (PMF) ocasionando desórdenes metabólicos secundarios que, en último término, inhiben la generación de energía y la síntesis de macromoléculas, lo que supone la muerte celular (Monteville et al, citado por Martínez, 1996; Grande et al, citado por Rojas y Vargas, 2007). La PMF es un gradiente electroquímico compuesto de un potencial de membrana (Ll4J) y de un gradiente de pH (LlpH), y es necesaria para llevar a cabo gran parte de los procesos dependientes de energía del metabolismo celular (Martínez, 1996). La hipótesis más aceptada sobre cqmo las bacteriocinas desestabilizan las membranas es que, en función de su carácter catiónico, éstas serían inicialmente atraídas electrostáticamente por la superficie celular (las bacteriocinas se adsorben inespec;íficamente a células sensibles, a resistentes y a las propias células productoras). Posteriormente, bien por la presencia de un . determinado potencial de membrana o por la interacción con un receptor específico o no, adoptarían una conformación 45 tal que les permitiría agregarse entre sí formando aglomerados que se reordenarían para dar lugar a una especie de cilindro hueco (poro) que atravesaría la matriz membrana!, manteniendo las zonas hidrofílicas hacia la parte interior del poro (Martínez, 1996). La composición y distribución de los fosfolípidos de la membrana celular influye en la eficiencia de la asociación de la bacteriocina con el citoplasma, su inserción y la formación del poro, es por este fenómeno que se debe la resistencia de algunos de los microorganismos patógenos frente a una bacteriocinas especifica (Cintas et al, citado por Rojas y Vargas, 2007). Otro mecanismo de acción propuesta sobre la permeabilidad de la membrana celular por parte de las bacteriocinas, es que estas desestabilizan la membrana a modo de un detergente biológico (Abee et al, Muriana, citados por Nuñez et al, 2007). Los resultados de numerosos experimentos apoyan la hipótesis ge formación de poros frente a la desestabilización de la membrana mediante una acción de tipo detergente (Monteville et al, citado por Martínez, 1996; Nuñez et al, 2007, González et al, 2003). Un esquema del modelo de poración se presenta en la Fig. 2. Los monómeros de bacteriocina se unen a la membrana citoplasmática a 46 través de uniones electrostáticas con los fosfolipídos cargados negativamente, luego se insertan en la membrana con una reorientación que depende del potencial de membrana. Este potencial podría estar influenciado por el pH y la composición fosfolipídica. Los monómeros se agregan resultando en la formación de un poro en la membrana, hacia adentro de la región de fosfolipídos se ubican los residuos hidrofílicos y hacia fuera los hidrofóbicos, con la consecuente salida de iones y la pérdida de la fuerza protón motriz (FPM) a la que le sigue la muerte celular. Figura N° 2 Interacción de los monómeros de bacteriocina con la membrana citoplasmática: modelo de complejo de poración [ Ba;jcina Membrana Celular Fuente: Doyle et al, 1997. Formación r de Poros 47 3.2.5 CRECIMIENTO BACTERIANO El crecimiento se define como un incremento en el número de células microbianas en una población, lo cual también puede ser medido como un incremento en la masa microbiana (Madigan et al, 1999). El ritmo de reproducción de las bacterias suele ser una simple división en dos nuevas células. El tiempo que tarda una población en duplicarse se llama tiempo generacional (Tg). Para las bacterias un ciclo de división se da cada veinte-treinta minutos (Madrid, 1996). Este ritmo de reproducción se ve frenado en la práctica por factores limitantes que condicionan la vida y desarrollo de las bacterias. 3.2.5.1 Factores que influyen ~n el crecimiento bacteriano Las bacterias, como todo ser vivo, necesitan unas condiciones especiales del medio que las rodea para podE?r desarrollarse adecuadamente. Es preciso distinguir entre las variaciones de las condiciones externas que pueden soportar y las condiciones optimas para su desarrollo. Factores intrínsecos.- se refiere a las propiedades físicas y a la composición química del propio alimento. Entre los factores intrínsecos 48 tenemos: Nutrientes, pH, actividad de agua, constituyentes antimicrobianos y la estructura del propio alimento. Factores extrínsecos.- determinado por los factores ambientales o características del ambiente donde se almacena el alimento: temperatura, humedad y tensión de oxigeno. Factores implícitos.- determinados por las relaciones que se establecen entre los microorganismos presentes en el alimento, entre las que se encuentran: la velocidad de crecimiento específica, antagonismo, comensalismo y sinergismo. Existen otros factores considerados de procesos, en la cual el alimento es sometido a tratamientos tecnológicos que modifican la microbiota inicial y repercuten en la composición final del producto. 3.2.5.2 Fases del crecimier-to Jlacteriano Siempre que se encuentres presente o se añadan microorganismos a un alimento y las condiciones del medio sean apropiadas, las células microbianas empezarán a multiplicarse, pasando por una serie de fases consecutivas. Cuando se hacen recuentos periódicos del número de células microbianas y los resultados obtenidos se expresan con el 49 logaritmo del número de células por g o mi y se representan gráficamente como ordenadas, y las unidades de tiempo se representan gráficamente como abscisas , se obtiene una curva de crecimiento bacteriano (Frazier y Westhoff, 2000). En la Figura N° 3 se presenta la curva típica de crecimiento de las bacterias, donde se distinguen cuatro fases. Vl ro t: .~ ,._ (]) +-' u ro al (]) '"O 01 z Fuente: Figura N° 3 Curva típica de crecimiento bacteriano Lag {A) Exponencia 1 {B) Tiempo Estacionaria (C) Adaptada de Madigan et al, 1999. Muerte (D) Fase Lag o de latencia: es el periodo de adaptación o aclimatación de la bacteria al medio para iniciar su crecimiento. La presencia o extensión de este periodo depende del inoculo (estado fisiológico, fase de crecimiento, 50 tamaño y tipo de microorganismo) y de la composición del medio en el que se inocula (condiciones fisicoquímicas del medio). Es decir, si las condiciones para el desarrollo de esta última son las adecuadas (temperatura, nutrientes, humedad, etc.) apenas necesitará adaptación alguna (Madrid, 1996). Fase exponencial: en esta etapa el crecimiento bacteriano es acelerado y la velocidad de multiplicación o tasa de crecimiento es constante (Frazier y Westhoff, 2000). Las condiciones del medio son las adecuadas y la producción de desechos metabólicos es poca para inhibir el desarrollo de la propia bacteria. Durante esta fase cada microorganismo se divide a intervalos constantes, y la población se doblará en el trascurso del tiempo de generación. Fase Estacionaria: en esta etapa a!Jn se reproducen las bacterias a un ritmo menos acelerado, produciéndose muertes de otras células existentes a una velocidad similar, equilibrándose el crecimiento bruto con las muertes celulares. En esta etapa se agotan los nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desechos metabólicos de las propias bacterias alcanzan niveles inhibitorios (Madrid, 1996). Fase de declive o muerte: en esta etapa el número de células que mueren es mayor que el número de células que se forman (Frazier y 51 Westhoff, 2000). Se presenta la lisis masiva exponencial del cultivo, debido al agotamiento de reservas de energía. 3.2.5.3 Modelamiento matemático del crecimiento bacteriano Las curvas de crecimiento bacteriano nos permiten obtener los parámetros cinéticos de crecimiento propios de la bacteria en un medio concreto. Estos parámetros vienen a ser la descripción matemática del comportamiento bacteriano. Estos parámetros nos permiten evaluar y caracterizar el comportamiento de la bacteria en un sustrato y tiempo determinado. Existen modelos matemáticos que nos permiten estimar la población bacteriana en función del tiempo. Entre los diferentes modelos matemáticos tenemos a los modelos primarios que tienen como objetivo describir matemáticamente la curva de crecimiento generada por los microorganismos de interés bajo condiciones ambientales definidas con el objeto de estimar los parámetros cinéticos que caracterizan dicha curva: tiempo de latencia, máxima velocidad específica de crecimiento y máxima densidad celular (Cayré et al, 2007). Entre los modelos primarios tenemos: modelos sigmoidales, entre los que se encuentran las versiones modificadas de los modelos Logístico y de Gompertz; modelos con una función de ajuste, como el propuesto por Baranyi y Roberts, y modelos de 52 compartimentos como el propuesto por Hills y Wrigth (Baty y Delignette­ Müller, citado por Cayré et al, 2007). La propiedad más importante de un modelo primario es que describa de forma adecuada el crecimiento de los microorganismos y permita obtener estimaciones precisas de los parámetros que caracterizan dicho crecimiento. Es así que uno de los modelos matemáticos más usados para estimar y ajustar el crecimiento microbiano es el modelo propuesto por Baranyi y Roberts en 1994 (Cayré et al, 2007). 3.2.5.3.1 Baranyi y Roberts El modelo de Baranyi y Roberts describe una curva bacteriana sigmoidea. La diferencia principal entre este modelo y otras curvas sigmoidales como la función modificada de Gompertz, ~1 modelo logístico, etc., es que las interfases son más lineales que l~s de aquellas curvas sigmoideas clásicas, las cuales tienen una mayor pronunciación en la curvatura de estas interfases (DMFit, 2009). El modelo de Baranyi y Roberts tiene 4 parámetros principales valor inicial (N0), Tiempo de latencia (A), velocidad máxima (IJmax) y el valor final (Nmax) (Figura N° 4 ). El modelo de Baranyi ha sido usado para ajustar las curvas de crecimiento comúnmente observadi3S en bacterias: curvas lineales, 53 aquellas con fase de latencia, aquellas con fase de muerte o declinación y curvas sigmoides (Xiong et al, citado por Carrillo et al, 2007). Carrillo et al (2007), uso el modelo de Baranyi para ajustar las curvas de crecimiento del hongo Rhizopus oryzae generadas a diferentes condiciones de crecimiento. El modelamiento permitió obtener los parámetros de crecimiento ajustados (velocidad específica de crecimiento, tiempo de latencia y crecimiento máximo). Figura N° 4 Parámetros cinéticos de crecimiento bacteriano en una curva típica: Modelo Baranyi y Roberts / .1 1' Valor Final Nf ----------------------~~-------~----_-_-_--_-_~ b.O .......... V -~ o ~ b.O .9 / A / Máxima Velocidad 7 No~----~-~-/f----------------------------- 1 T Lag 1 / u o Tiempo Fuente: DMFit, 2009. 54 La expresión matemática del modelo de Baranyi y Roberts citado por Cayré et al (2007) es: y(t) = Ymax + Ln ----------------[ -1 + exp (!Jmax-A) + exp (!Jmax.t) -1 + exp (!Jmax.t) + exp (!Jmax.A + Ymax- Yo) Donde: y(t) =In N(t), siendo N(t) la densidad bacteriana (ufc.g-1 ) al tiempo t. Yo = In No, siendo N0 el valor asintótico inferior y aproximadamente igual a la densidad bacteriana inicial (ufc.g-1 ). Ymax = In Nmax. siendo Nmax el valor asintótico superior y aproximadamente igual a la máxima densidad bacteriana (ufc.g-1 ). J.lmax = máxima velocidad específica de crecimiento (tiempo-1 ) o tasa de mortalidad máxima (letalidad) en caso de una curva de supervivencia. A= tiempo de latencia o retraso (tiempo). Definida generalmente como la intersección entre la tangente a la fase de crecimiento exponencial y el valor inicial. 55 3.2.6 Escherichia coli 3.2.6.1 Características generales Taxonómicamente las bacterias de la especie Escherichia co/i pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos cortos, gram negativos, quimioheterotrofos, catalasa positiva, oxidasa negativa, anaerobios facultativos. Produce ácido y gas a partir de la glucosa, lactosa, fructosa, galactosa, maltosa, arabinosa, xilosa, ramnosa y manito!. La mayoría de las cepas fermentan la lactosa, aunque algunas son fermentadoras lentas de este azúcar. Nunca fermenta la dextrina, almidón, glucógeno e inositol (Dos santos, 2007). La mayoría de las cepas pertenecientes a la especie Escherichia coli, forman parte de la microflora norma,l del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente, encontrándose habitualmente en las heces. Es por ello que su presencia en los alimentos es índice de contaminación fecal y señala un peligro potencial de posibles patógenos entéricos. 3.2.6.2 Escherichia co/i: indicador de Higiene En 1920, se introdujo la utilización del grupo total de las bacterias del grupo coliformes como marcadores en el análisis microbiológico de la 56 leche pasteurizada y de los helados, basándose en el principio de que un tratamiento térmico adecuado habría de eliminar todas las bacterias presentes de este grupo y de que el envasado debería impedir la recontaminación del producto (Dos santos, 2007). Pero en la actualidad se distinguen dos grupos de microorganismos indicadores: • Aquellos cuya presencia en los alimentos señala la posible presencia simultánea de gérmenes patógenos ecológicamente relacionados. Tales microorganismos podrían ser denominados "índices". El microorganismo clásico es Escherichia coli. • Aquellos cuya presencia en los alimentos indica deficiencias en su calidad higiénica. El término "microorganismos indicadores" sería utilizado para este grupo de bacterias. Los microorganismos indicadores más conocidos son los coliformes. En la leche ;•r. pasteurizada, por ejemplo, la existencia de bacterias de este grupo en número que exceda a un valor de referencia experimental y legalmente establecido puede poner de manifiesto o advertir diversas deficiencias de este producto, entre ellas un tratamiento térmico insuficiente, una contaminación posterior al tratamiento, o un almacenamiento del producto final a una temperatura demasiado elevada (Dos santos, 2007). 57 Escherichia coli puede actuar como índice o como indicador, incluso en un mismo alimento. Por ejemplo, su presencia en número significativo en camarones precocidas y congeladas pone de manifiesto o un tratamiento de inocuidad inadecuado (función indicadora), o la posible presencia de microorganismos patógenos de procedencia entérica (función de índice) (Dos santos, 2007). 3.2.6.3 Escherichia coli enteropatógeno Los serotipos de Escherichia coli a los cuales se les ha relacionado con enfermedades diarreicas en hombres o brotes de intoxicaciones alimentarias han sido denominados Escherichia co/i enteropatógeno (EPEC). En el hombre, los síndromes de enfermedad como consecuencia de la ingestión de EPEC se han dividido en dos grupos principales. El primer grupo está integrado por cep;:ts que elaboran una enterotoxina y que producen una enfermedad parecida ·al cólera o enfermedad enterotoxigénica en las personas (Ver Tabla N° 6). Estas cepas enterotoxigénicas suelen producir dos enterotoxinas, una toxina termoestable y otra toxina termolábil, creyéndose que son las causantes de las enfermedades diarreicas de los niños y de la diarrea del viajero. Para que se desencadene las enfermedades enterotoxigénicas, se precisa la ingestión de serotipos de EPEC capaces de elaborar las enterotoxinas, seguida de la colonización de los microorganismos en el 58 tramo superior del intestino delgado y de la producción de las enterotoxinas. Parece ser que las enterotoxinas intervienen en el paso de agua a la luz intestinal. Esta acumulación de líquido tiene lugar sin que se produzca ninguna modificación macroscópica importante en el epitelio intestinal y sin que exista penetración ni invasión de las bacterias. El otro gran grupo está integrado por cepas invasoras que elaboran una citotoxina y originan una enfermedad invasora, colitis, o un síndrome disenteriforme. Estos serotipos no elaboran enterotoxinas se multiplican en el colon, e invaden ó penetran en las células epiteliales de su mucosa, produciendo los signos y síntomas que se describen en la Tabla N° 6. Para que se presente tanto la enfermedad enterotoxigénicas como la enfermedad invasora, se necesita una elevada dosis de EPEC. Por consiguiente para que tenga lugar una abundante multiplicación, los alimentos deben estar contaminados masivamente o deben estar incorrectamente conservados o refrig~rados (Frazier y Westhoff, 2000). 59 Tabla N°6 Caracteres de las enfermedades producidas por EPEC Agente causal Periodo de Sintomatología Alimentos incubación implicados Fiebre, escalofríos, Cepas De 8 a 44 cefalalgia, mialgia, enterotoxigénicas horas, con retortijones abdominales, una media de abundante diarrea 26 h acuosa (parecida a la Sucedáneos shigelosis) del café, salmón, queso. De 8 a 24 Diarrea (deposición que Cepas invasoras horas, con parece agua de arroz), una media de vómitos, deshidratación 11 h (parecida al cólera) Fuente: Frazier y Westhoff, 2000 3.2.6.4 Condiciones de crecimiento del Escherichia co/i La temperatura optima de crecimiento del microorganismo es de 37 °C, con un intervalo de crecimiento de 10-40 oc (Frazier y Westhoff, 2000). Algunas cepas de Escherichia c;oli patógeno son capaces de crecer a temperaturas tan bajas como 7 oc y tan altas como 46 °C. Sin embargo, Escherichia coli 0157:H7 tiene un i!ltervalo de crecimiento ligeramente más limitado, con una temperatura mínima de crecimiento de 8 °C, una máxima de aproximadamente 44 - 45 oc y una óptima de 37 °C (Dos santos, 2007). Este microorganismo es relativamente termosensible y puede ser destruido con facilidad a temperaturas de pasteurización, 60 mediante la cocción del alimento y también durante su almacenamiento en frío, sobre todo a la temperatura de congelación. Su pH optimo de crecimiento es de 7.0 a 7.5, con un pH mínimo de crecimiento de valor 4.0 y un pH máximo de crecimiento de valor 8.5 (Frazier y Westhoff, 2000). Para Fuller, citado por Rodríguez (1994), el crecimiento del Escherichia coli puede detenerse ajustando el pH de un medio de cultivo a 4,5 mediante la adición de ácido láctico o clorhídrico. Este mismo autor administró leche fermentada por Streptococcus thermophi/us y Lactobacillus bulgaricus a lechones destetados, observando cómo descendía el recuento de Escherichia coli en estómago y duodeno, afirmando que el efecto originado por el yogurt podía ser reproducido por leche acidificada con ácido láctico a un pH de 4,2. En cuanto a la aw, se ha determinado que el Escherichia coli puede crecer en un 6 % de NaCI y toleran mejor el cloruro sódico y nitrito sódico que las cepas típicas de Salmonella spp. La cepa Escherichia coli 0157:H7 es capaz de crecer, aunque lentamente, en un caldo que contenga 6.5 % de NaCI, pero no al 8.5% (ICMSF, citado por Dos santos, 2007). 61 3.2.6.5 Escherichia coli ATCC 25922 El Escherichia co/i (Migula) Castellani y Chalmers, es una cepa control del American Type Culture Collection (ATCC), cuyo número ATCC es 25922, es un organismo aislado de casos clínicos. Su aislamiento se da en medios selectivos a 37 oc en condiciones de aerobiosis. Así mismo, está clasificado con un nivel de bioseguridad de grado 1, presentando un riesgo biológico mínimo para la salud (ATCC, 2011 ). Esta cepa bacteriana puede ser utilizada como control en una gran variedad de utilidades, lo cual nos permite conocer el grado de confiabilidad de los productos comerciales o elaborados en el laboratorio. En la actualidad la cepa de Escherichia coli ATCC 25922 es ampliamente utilizado como un control de bacterias Gram negativas para diversps experimentos de laboratorio, especialmente para los ensayos de susceptibilidad a los antibióticos (Uri, 1994 ). Además, tiene otras aplicacion~s en las que destacan: el control de tensión, detección de Escherichia coli y bacterias coliformes, evaluación de agar Mueller-Hinton, medios de pruebas de control de calidad y pruebas de sensibilidad de disco: cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, ceflomicina, gentamicina, tetraciclina, entre otros. 62 3.2. 7 VIDA UTIL 3.2.7.1 Definición La aptitud para el consumo de un alimento no solo comprende el estado higiénico-sanitario del alimento, sino también el valor nutricional y el sensorial. En definitiva, la calidad, entendida como la adecuación del producto al uso o consumo a que va destinado según la percepción subjetiva del consumidor (Hernández et al, 1999). Bajo esta percepción distintos autores han definido el concepto de vida útil de la siguiente manera: Para Hernández et al (1999), la durabilidad o vida útil, es el periodo entre la elaboración y la compra al detalle de un producto alimenticio, durante el cual dicho producto mantiene una ca.lidad satisfactoria. Otra definición del mismo autor sería el tiempo durante el almacenamiento en el que el producto mantiene su aptitud para el consumo. Para Cantillo et al, citado por Novoa y López (2008), la vida útil de un alimento es el tiempo durante el cual este conserva su integridad nutritiva, sus características organolépticas y su calidad microbiológica. 63 Finalmente, podemos definir a la vida útil del alimento, como el momento en que uno o varios atributos de calidad se ven alterados como consecuencia del paso del tiempo, de las condiciones de manipulación y de almacenamiento posteriores a su elaboración, y que limite su aceptabilidad o implique un riesgo para la salud del consumidor. 3.2.7.2 Evaluación de la vida útil de un alimento Los estudios de vida útil son importantes para definir la duración de los alimentos, siendo necesario para no sub o sobre dimensionar el tiempo que realmente dura el producto (Valencia et al, 2008). Para poder evaluar el tiempo de vida útil será necesario definir un indicador de calidad. Este indicador varía en función del tiempo y puede ser medido a través de pruebas fí~ico-químicas (rancidez, oxidación), biológicas (incremento de microorganismos) y/o pruebas sensoriales del alimento (cambios de olor, color, y textura). El estudio de vida útil se basa en la evaluación de la calidad del indicador en función del tiempo. El tiempo que demora el indicador al llegar al límite critico es lo que se conoce como tiempo de vida útil. Pasado ese tiempo el alimento se le considera deteriorado o no apto para el consumo. El 64 indicador y su límite crítico dependen de la naturaleza y composición del alimento y la normativa sanitaria vigente .. Novoa y López (2008), evaluó la vida útil del queso doble crema con dos niveles de grasa, mediante pruebas sensoriales, basándose no en el deterioro del producto, sino sobre el rechazo del consumidor hacia el producto, ya que la calidad del producto cambia durante su almacenamiento dependiendo del contenido de grasa, la cual tiene un papel importante en el desarrollo del sabor, aroma y textura durante el almacenamiento, que pueden llevar a cambios en el grado de aceptabilidad y por lo tanto su vida útil se puede afectar. En el caso de productos perecederos, como el queso fresco, un producto fresco, de corta vida útil, el cual proporciona las condiciones óptimas de crecimiento bacteriano, se realiza la evaluación de su vida útil basado en su calidad higiénico-sanitaria. En este tipo de alimentos las pruebas sensoriales pueden llevar a un tie~po de vida útil errado, puesto que sensorialmente puede ser apto, pero la calidad sanitaria puede implicar un riesgo para el consumidor. Lo mismo sería si se consideraría como indicador al contenido de grasa para evaluar su vida útil, ya que su contenido de grasa no se ve alterado en gran medida por las condiciones de almacenamiento y por qué no posee proceso de maduración en la cual si existen fenómenos como la lipólisis, cuya descomposición de la materia 65 grasa generaría un cambio en la calidad del producto. Entonces, el estudio de la vida útil del queso fresco se basa en el tiempo en la cual se supera el recuento de células bacterianas permitida por la norma sanitaria vigente. Grisius et al, y Hough et al, citados por López Orozco (2004 ), consideran además de los diversos factores que intervienen en la evaluación de la vida de anaquel en productos lácteos, a la cuenta microbiológica como un índice definitivo para determinar el tiempo de vida de anaquel final en estos productos. En la figura N°5, se muestra un ejemplo para determinar la vida útil de un · alimento que contiene 2% de NaCI, pH 6.2 y dos temperaturas de almacenamiento ( 1 o y 20 °C), los crecimientos bacterianos fueron simulados con el ComBase Predictor (201 0), tomando como indicador microbiológico las células E. coli presentes en el alimento, cuyo límite critico considerado seria un recuento de 103 Ufc/g. En esta simulación se puede observar que el tiempo de vida útil del alimento se determina trazando una perpendicular a las abscisas (Tiempo), desde el punto de intercepción de la curva de crecimiento y el limite critico establecido. El crecimiento del E. coli a 20 oc determino un tiempo de vida útil menor a 24 horas, mientras que el crecimiento del E. 66 coli a 1 o °C permitió un tiempo de vida útil de 150 horas. Este ejemplo nos muestra que la temperatura de almacenamiento es fundamental para inhibir el crecimiento bacteriano y en particular para el E. coli. Figura N°5 Simulación de la estimación de la vida útil del queso fresco a determinadas condiciones de almacenamiento. 10 .---------------------------------------- 9 +------------------------------------------- 7 +-------+----------------------------------- b.O 6 -+-------1--------------------------------......... ~ :J S +-------1-------------------- b.O ~ 4 +----~----------------------------~~------ limite Critico o 24 4S 72 96 120 144 168 192 216 240 Horas Fuente: ComBase Predictor, 2010 (Versión en línea). CAPITULO IV MATERIALES Y MÉTODOS A. LUGAR DE EJECUCIÓN 67 La presente investigación se llevó a cabo en las instalaciones del Centro Experimental Tecnológico de la Universidad Nacional del Callao (CET). La elaboración de los quesos frescos experimentales se realizó con técnicas artesanales, llevándose a cabo en la planta piloto del CET. Asimismo los análisis fisicoquímicos y microbiológicos necesarios para la realización de este trabajo, se efectuaron en los laboratorios de análisis microbiológicos y en el laboratorio de análisis químico del GET, entre los meses de enero y agosto del 201 O. B. MATERIA PRIMA E INSUMOS 8.1 Materia prima La leche fresca de vaca fue adquirida del Establo Lima-Norte, ubicada en la Av. Chacra cerro S/N Carabayllo, el cual posee las instalaciones adecuadas de ordeño semiautomático, realizándose el ordeño dos veces al día (4 am y 5 pm). Posterior al ordeño la leche se mantuvo en un 68 depósito de almacenamiento refrigerado de acero inoxidable hasta el momento de su venta. El transporte de la leche al centro de producción fue en una galonera de capacidad 20 Litros, cuyo material fue polipropileno A/D blanco de primer uso (plástico virgen). Figura N° 6 Galonera para el transporte de la leche 8.2 Cepas Experimentales El cepario de Lactobacillus casei ATCC 393™ y Escherichia coli ATCC 25922™, fueron proporcionadas por el Laboratorio de Microbiología de LA MOLINA CALIDAD TOTAL. 8.3 lnsumos para la elaboración del queso fresco • Cuajo Marschall L75, marca DANISCO. • Cloruro de calcio p.a. JM. Chemical. 69 • Sal común. C. MATERIALES Y EQUIPOS C.1 Materiales • Matraces de 250 mi • Pipetas de 1 y 1 O mi. • Probetas de 1 00 mi • Placas Petri • Bureta de 25 mi • Vaso precipitado de 50 mi • Luna de reloj • Espátula de acero inoxidable • Tubos de ensayo de 150 mm x 20 mm • Bolsas estériles para Homogenizador Stomacher® C.2 Equipos • Estufa esterilizadora, marca Memmert 20 oc a 250 oc (Alemania). • Estufa incubadora, marca Memmert 20 oc a 50°C (Alemania). • Equipo de Baño Maria, marca Memmert 20 oc a 120°C (Alemania). • Balanza analítica, marca Ohaus modelo adventurer (USA). 70 • Contador de colonias tipo "Quebec", marca Karl Kolb (Alemania). • Refrigeradora, marca Faeda. • Homogenizador Stomacher® Mod.400 (Alemania). • Potenciómetro, marca VWR Scientific Mod.8025 (Alemania) C.3 Reactivos/Medios de Cultivo • Agua Peptonada Tamponada, Merck. • Agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS), Difco TM. • Agar Mac Conkey, Merck. • Caldo Man, Rogosa y Sharpe (MRS), !3ritania®. • Caldo Maltosa, Merck. • Hidróxido de Sodio (NaOH). J.M Chemical. • Alcohol Etílico comercial de o 70. 4.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN La presente investigación se caracterizó por ser longitudinal estudiando la variable a lo largo del tiempo establecido, por ser éste el determinante en . la relación causa efecto. Según el análisis y alcance de los resultados fue de tipo Experimental porque permitió manipular el factor causal para determinar el efecto dese~do. Además f!,Je Aplicada porque el fin de este 71 proyecto fue resolver un problema de naturaleza práctica permitiendo aplicar los resultados. La investigación tuvo un diseño experimental, donde se estudiaron un grupo control y 3 tratamientos con 3 repeticiones cada una. Las variables estudiadas fueron la concentración (ufc/mL) de Lactobacil/us casei ATCC 393 TM y su efecto inhibitorio frente al crecimiento de las ufc/g de Escherichia coli. Cada iteración se realizó cada 24 horas y quedo determinado el diseño de la investigación de la siguiente manera: Grupo control (C): Queso fresco experimental, Escherichia co/i a una concentración de 103 ufc/mL inoculado con Tratamiento Experimental 1 (T1): Queso fresco experimental, inoculado con Escherichia co/i a una concentración de 1 03 ufc/mL y con Lactobacil/us casei ATCC 393 TM a una concentración de 1 03 ufc/mL Tratamiento Experimental 2 (T2): Queso fresco experimental, inoculado con Escherichia coli a una concentración de 1 03 ufc/mL y con Lactobacil/us casei ATCC 393 TM a una concentración de 1 06 ufc/mL 72 Tratamiento Experimental 3 (T3): Queso fresco experimental, inoculado con Escherichia coli a una concentración de 1 03 ufc/ml y con Lactobacil/us casei ATCC 393 TM a una concentración de 109 ufc/ml (*)Vida útil del queso fresco: Independiente de este diseño se elaboraron quesos frescos mediante técnicas artesanales, sin conservantes y sin inoculación de bacterias iniciadoras, ni experimentales. Estos quesos permitieron la estimación de su vida (ltil, en ·nuestras condiciones experimentales. 4.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Los quesos frescos experimentales fueron elaborados e inoculados con las bacterias experimentales de acuerdo al diseño experimental, de los cuales se realizó un muestreo diariamente, la cual permitió su análisis . correspondiente. El periodo de análisi~ fue de 10 días considerando el día de producción (día O) Posterior a su elaboración y al muestreo, el producto se mantuvo almacenado en refrigeración a una temperatura de 8 ± 2 oc durante 1 O días. En la Figura N° 7 se esquematiza la secuencia del trabajo experimental. 73 Figura N° 7 Diseño experimental del estudio ---------------------. : C1: 10aE. coli 1 : C2: 1 03E. coli + 1 03L. casei 1 1 C3: 1 03E. coli + 1 06L. casei : C4: 103E. colí + 109L. caseí L --- ---- -- - ---- - - - - - - _1 Acidez Titulable Humedad Caracterización de la Leche Proceso de Elaboración (Moldeado) QUESOS FRESCOS • Análisis Fisicoquímico • Análisis Microbiológico } Quesos Frescos Control y Experimentales Análisis Microbiológico BAL L----, 1 1 t Coliformes Curvas de crecimiento bacteriano Modelo de Baranyi y Roberts (Cayréet al, 2007) { Modelamiento parámetros cinéticos de crecimiento '------~--~ /-"\ 1 74 4.3 METODOS DE ANALISIS 4.3.1 LECHE FRESCA 4.3.1.1 Análisis Fisicoquímico a. Determinación de pH (NMX-F-317-S: 1978) La determinación de pH se realizó mediante un potenciómetro VWR Scientific. El cual se calibr