INFORMACIÓN BÁSICA FACULTAD : Ingeniería Química UNIDAD DE INVESTIGACIÓN : Facultad de Ingeniería Química TÍTULO : Condiciones favorables para la obtención de bioetanol a partil de molle (Schinus molle) a nivel de laboratorio. AUTORES Andrés Genderson Huamán Aliaga / ORCID: 0009–0000–7846–361X / DNI: 46214763 Verónica Maccha Cabello / ORCID: 0009–0006–4440–2337 / DNI: 44870733 ASESOR : Luis Américo Carrasco Venegas / ORCID: 0000–0002–7832–3366 / DNI: 25825871 LUGAR DE EJECUCIÓN : Laboratorio de Investigación y Desarrollo de la empresa IMBAREX S.A. Lima – Perú UNIDAD DE ANÁLISIS ; Fibra de molle (Schinus molle). TIPO DE INVESTIGACIÓN : Aplicada / Enfoque: Cuantitativo / Nivel: Explicativo TEMA OCDE : 2.4.2. Tecnología e ingeniería PRÓLOGO DEL JURADO La presente Tesis fue sustentada por los Bachilleres MACCHA CABELLO VERONICA y HUAMÁN ALIAGA ANDRÉS GENDERSON ante el Jurado de Sustentación de Tesis conformado por los siguientes docentes ordinarios de la Universidad Nacional del Callao: ING° DIAZ BRAVO PABLO BELIZARIO Presidente ING° MEDINA COLLANA JUAN TAUMATURGO Secretario Lic TRUJILLO PEREZ SALVADOR APOLINAR Vocal ING° CARRASCO VENGAS LUIS AMÉRICO Asesor Tal como está asentado en el Libro de actas N° 02 Folio N° 159 y Acta N° 340 de fecha veintiséis de diciembre de 2024, para optar el Título Profesional de Ingeniero Químico en la Modalidad de Tesis sin Ciclo de Tesis, de conformidad a lo dispuesto en el Reglamento de Grados y Títulos de la Universidad Nacional del Callao, aprobado por Resolución de Consejo Universitario N° 286–2024–CU del 27 de noviembre de 2024 DEDICATORIA El presente trabajo de tesis está especialmente dedicado a Jehová, nuestro Dios, por habernos dado la vida y las fuerzas para poder lograr nuestros objetivos. A nuestros padres, por su amor incondicional, apoyo y comprensión durante estos años de estudio. Gracias por ser nuestro pilar y por creer en nosotros. AGRADECIMIENTO Queremos expresar nuestro más sincero agradecimiento a Dios, a nuestros padres, hermanos y nuestras familias por motivarnos y apoyarnos a concluir con éxito la tesis que en un principio parecía ser una tarea ardua e interminable. Al Ing° Luis Américo Carrasco Venegas, gracias por su apoyo y todo el tiempo invertido en este trabajo, a nuestros maestros de la Facultad de Ingeniería Química, por su gran apoyo y motivación, por su asesoramiento ofrecido en esta tesis. Finalmente, a la Universidad Nacional del Callao, porque en sus aulas tuvimos la oportunidad de formarnos como profesionales. ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS 9 ÍNDICE DE FIGURAS 10 ÍNDICE DE ABREVIATURAS 12 RESUMEN 13 ABSTRACT 14 INTRODUCCIÓN 15 I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 17 1.1. Descripción de la realidad problemática 17 1.2. Formulación del problema 17 1.3. Objetivos Objetivo general 18 1.4. Justificación 18 1.5. Delimitantes de la investigación Teórico 19 II. MARCO TEÓRICO 21 2.1. Antecedentes: internacional y nacional Internacional 21 2.2. Bases teóricas 27 2.2.1. Biotecnología 27 2.2.2. Materiales lignocelulósicos 28 2.2.3. Pretratamiento de los materiales lignocelulósicos 29 2.2.4. Proceso de obtención de alcohol orgánico a partir de material lignocelulósico 34 2.3. Marco conceptual 38 2.3.1. Molle 38 2.3.2. Hidrólisis 40 2.3.3. Fermentación 43 2.3.4. Tipos de fermentación Fermentación alcohólica 44 2.4. Definición de términos básicos 45 III. HIPÓTESIS Y VARIABLES 47 3.1. Hipótesis (general y específicas) General 47 3.1.1. Operacionalización de variable 47 7 IV. METODOLOGÍA DEL PROYECTO 49 4.1. Diseño metodológico 49 4.2. Método de investigación Primera etapa 49 4.3. Población y muestra 56 4.4. Lugar de estudio y período desarrollado 56 4.5. Técnicas e instrumentos para la recolección de la información 56 4.6. Análisis y procesamiento de datos 57 4.7. Aspectos éticos en investigación 58 V. RESULTADOS 60 5.1. Resultados descriptivos 60 5.2. Resultados inferenciales 63 5.3. Otro tipo de resultados estadísticos 65 VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 67 6.1. Contrastación y demostración de la hipótesis con los resultados Contrastación con la hipótesis general 67 6.2. Contrastación de los resultados con otros estudios similares 68 6.3. Responsabilidad ética de acuerdo a los reglamentos vigentes 69 VII. CONCLUSIONES 70 VIII. RECOMENDACIONES 71 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72 ANEXOS 75 8 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Operacionalización de variables. 48 Tabla 2. Diseño experimental para las pruebas de estudio de las condiciones de hidrólisis 51 Tabla 3. Preparación de la curva de calibración para la cuantificación de azúcares fermentables 54 Tabla 4. Preparación de la curva de calibración para la determinación del contenido de alcohol 56 Tabla 5. Resultados de la hidrólisis ácida 60 Tabla 6. Resultados del índice de refracción y de la concentración de bioetanol obtenido para la fermentación con 0,25 g/L de Saccharomyces Cerevisiae. 61 Tabla 7. Resultados del índice de refracción y de la concentración de bioetanol obtenido para la fermentación con 0,5 g/L de Saccharomyces Cerevisiae. 62 Tabla 8. Puntos de la curva de calibración Concentración de glucosa (g/L) vs Absorbancia 66 Tabla 9. Puntos de la curva de calibración Concentración de etanol (%) vs Índice de refracción 66 9 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Composición de material lignocelulósico .............................................. 29 Figura 2. Representación esquemática del proceso de pretratamiento ................ 30 Figura 3. Pretratamiento mecánico del material lignocelulósico ........................... 31 Figura 4 Pasos para la obtención de etanol ........................................................ 33 Figura 5. Generaciones de producción de etanol ................................................ 34 Figura6. Modelo de producción de bioetanol a partir de material lignocelulósico .. 35 Figura 7. Representación esquemática del proceso de hidrólisis ......................... 36 Figura 8. Esquema del proceso de fermentación para la producción de ............. bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica ........................................ 37 Figura 9. Esquema del proceso de la deshidratación del etanol por destilación azeotrópica ......................................................................................... 38 Figura 10. Molle (Schinus molle) ......................................................................... 39 Figura 11. Relación de las variables de la investigación ........................................ 47 Figura 12. Materia prima utilizada en la investigación ........................................... 50 Figura 13. Acondicionamiento de la materia prima ................................................ 50 Figura 14. Secado de la materia prima .................................................................. 51 Figura 15. Hidrólisis ácida de las muestras de molle ............................................. 52 Figura 16. Preparación de las muestras para la hidrólisis ácida............................. 53 Figura 17. Levadura utilizada para la fermentación ............................................... 55 Figura 18. Concentración de bioetanol (%) obtenido de la fermentación para cada prueba con 0,25 g/L de levadura Saccharomyces cerevisiae ................ 61 Figura 19. Concentración de bioetanol (%) obtenido de la fermentación para ........ cada prueba con 0,5 g/L de levadura Saccharomyces cerevisiae ......... 62 Figura 20. Superficie de respuesta de la cantidad de azúcares fermentables.. versus concentración del ácido y temperatura (tiempo promedio) ......... 64 Figura 21. Superficie de contornos de la cantidad de azúcares fermentables .. versus concentración del ácido y temperatura (tiempo de hidrólisis 10 180 min) ................................................................................................... 64 Figura 22. Superficie de contornos de la cantidad de azúcares fermentables .. versus concentración del ácido y temperatura (tiempo de hidrólisis 240 min). ............................................................................................. 64 Figura 23. Ecuación de regresión en unidades no codificadas............................... 65 Figura 24. Optimización de las condiciones de hidrólisis ácida ............................. 65 11 ÍNDICE DE ABREVIATURAS DNS: Ácido 3,5 – dinitrosalicílico NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido NAD+: Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida) v/v: relación volumen – volumen 12 RESUMEN La presente investigación tuvo como objetivo encontrar las condiciones favorables para la obtención de bioetanol a partir de molle (Schinus molle) a nivel de laboratorio. Se recolectó la materia prima, proveniente de Huancayo – Perú y se preparó para las pruebas eliminando la corteza y rallando la madera para facilitar la hidrólisis. Luego, se secó la madera a 45°C durante 24 horas. Se realizaron pruebas de hidrólisis ácida según un diseño específico, utilizando soluciones de ácido sulfúrico al 1%, 2% y 4%. Las muestras se calentaron a 100°C y 120°C en el rango de 180 a 240 minutos. Posteriormente, se verificó la presencia de azúcares fermentables mediante el método DNS y se llevó a cabo la fermentación con levadura Saccharomyces cerevisiae a diferentes condiciones de concentración de levadura, temperatura y tiempo. Los destilados se analizaron mediante el índice de refracción para determinar el contenido de alcohol. Se determinaron las condiciones más favorables de obtención de bioetanol. Esto se logró maximizando la cantidad de azúcares fermentables y permite la obtención de valores cercanos a 35 % de bioetanol. En base a la optimización mediante superficie de respuesta se concluye que la temperatura de hidrólisis ácida es de 120°C, en 240 minutos y 2,78 g/L para la concentración de ácido sulfúrico (cc) Palabras clave: molle, hidrólisis, fermentación, bioetanol 13 ABSTRACT The present research aimed to find favorable conditions for obtaining bioethanol from molle (Schinus molle) at laboratory level. The raw material was collected from Huancayo – Peru and prepared for testing by removing the bark and shredding the wood to facilitate hydrolysis. Subsequently, the wood was dried at 45°C for 24 hours. Acid hydrolysis tests were conducted according to a specific design, using sulfuric acid solutions at 1%, 2%, and 4%. Samples were heated to 100°C and 120°C within a range of 180 to 240 minutes. Subsequently, the presence of fermentable sugars was verified using the DNS method, and fermentation was carried out with Saccharomyces cerevisiae yeast under different conditions of yeast concentration, temperature, and time. Distillates were analyzed using refractive index to determine alcohol content. The most favorable conditions for obtaining bioethanol were determined. This was achieved by maximizing the amount of fermentable sugars and allows obtaining values close to 35% of bioethanol. Based on the optimization using response surface, it is concluded that the acid hydrolysis temperature is 120°C, in 240 minutes and 2,78 g/L for the sulfuric acid concentration (cc) Keywords: molle, hydrolysis, fermentation, bioethanol 14 INTRODUCCIÓN Los combustibles fósiles representan aproximadamente el 80% de la demanda actual de energía primaria a nivel global. Sin embargo, la explotación excesiva de estos recursos ha generado dos problemas principales: el deterioro ambiental y la escasez de energía a nivel mundial. Esto plantea la necesidad porque la sociedad busque nuevas tecnologías para producir etanol a partir de residuos agrícolas, forestales, desechos sólidos y cualquier material que contenga celulosa y hemicelulosa. De esta manera, se podría revalorizar los desechos de diversas industrias y utilizarlos como materia prima para la producción de alcohol. El uso de combustibles de base biológica permite reducir de manera importante la acumulación de gases de efecto invernadero y la dependencia a combustibles fósiles [1] La búsqueda de una alternativa renovable debe lograrse mediante el uso de materiales lignocelulósicos para producir etanol, debido a ser abundantes y relativamente baratos [2] A pesar porque los procedimientos son caros en el presente, los progresos en biotecnología deberían conducir a una reducción significativa en el costo de transformar estos materiales en etanol. La posibilidad de producir etanol de biomasa de bajo costo debe ser la clave para que el etanol sea competitivo al compararlo con la gasolina [3] La utilización de biomasa celulósica en la fabricación de etanol ha tenido un impacto positivo en el medio ambiente. Si se implementa a gran escala como combustible para el transporte, el bioetanol puede contribuir de manera 15 significativa a la disminución de las emisiones de CO2 y otras sustancias contaminantes (como SO2 y NO2) provenientes de los vehículos. El etanol celulósico puede reducir el efecto invernadero. Estas tecnologías alternativas que pueden sustituir a las técnicas actuales de producción aún no están disponibles a la escala necesaria, por lo que se espera que estas técnicas persistirán de corto a medio plazo [3] En el presente informe de tesis se tuvo como objetivo principal de estudio, la obtención de etanol a partir de molle (Schinus molle), que es un árbol común a lo largo de la costa y sierra de nuestro país y que muchas veces es mal utilizado, dándole uso solamente como leña o carbón. Para esto se realizó un estudio experimental en el laboratorio de investigación y desarrollo de la empresa IMBAREX S.A. Lima – Perú Nuestro objetivo es ofrecer una contribución basada en la investigación realizada por otros autores, centrada en la implementación de nuevas tecnologías que aumenten la producción de bioetanol y disminuyan el daño ambiental, además de fomentar el desarrollo del país. 16 I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.1. Descripción de la realidad problemática La realidad problemática para encontrar las condiciones favorables para la obtención de bioetanol a partir de madera de molle radica en la necesidad de desarrollar una tecnología eficiente y sostenible que permita aprovechar esta fuente de biomasa como una alternativa viable a los combustibles fósiles. La madera de molle, siendo una biomasa lignocelulósica, presenta desafíos específicos para su conversión en bioetanol debido a su compleja estructura y composición. La lignina, un polímero resistente presente en la madera, dificulta el acceso a los componentes celulósicos, lo que requiere pretratamientos adecuados para facilitar la sacarificación enzimática. Además, para que el proceso sea económicamente viable, se deben optimizar las etapas de sacarificación y fermentación para obtener altos rendimientos de bioetanol con el menor uso posible de enzimas y levaduras. 1.2. Formulación del problema Problema general ¿Cuáles serán las condiciones más favorables para la obtención de bioetanol a partir de molle (Schinus molle) a nivel de laboratorio? Problemas específicos 1) ¿Cómo determinar las condiciones favorables en la hidrólisis de la madera de molle? 2) ¿Cómo determinar las condiciones favorables en la fermentación del hidrolizado de la madera de molle? 17 1.3. Objetivos Objetivo general Determinar las condiciones más favorables de obtención de bioetanol a partir de molle (Schinus molle) a nivel de laboratorio. Objetivos específicos 1) Determinar las condiciones favorables en la hidrólisis de la madera de molle. 2) Determinar las condiciones favorables en la fermentación del hidrolizado de la madera de molle. 1.4. Justificación La determinación de las condiciones favorables para la obtención de bioetanol a partir de molle (Schinus molle) a nivel de laboratorio es crucial por varias razones. En primer lugar, el bioetanol es una fuente de energía renovable y sostenible, lo que contribuirá a reducir la dependencia de combustibles fósiles y mitigar el impacto ambiental. Además, el molle es una fuente prometedora para la producción de bioetanol debido a su disponibilidad y capacidad de crecimiento rápido. La investigación de condiciones óptimas en el laboratorio permitió maximizar el rendimiento de bioetanol, optimizando factores como temperatura, concentración de sustrato y tiempo de fermentación, abriendo el camino para una producción eficiente y económicamente viable a mayor escala. Además, se justifica de forma legal, teórica y tecnológicamente de acuerdo a lo mostrado a continuación. Legal En la presente investigación se cumple con las regulaciones ambientales y de seguridad vigentes, se mencionan a continuación: 18 Ley General del Ambiente (Ley N° 28611) Ley de Seguridad y Salud en el Trabajo (Ley N° 29783) Ley del Sistema Nacional de Evaluación de Impacto Ambiental (Ley N° 27446 Reglamento de Protección Ambiental para las Actividades de Explotación de Recursos Naturales (D.S. N° 015–2007–EM) Reglamento de Transporte de Mercancías Peligrosas por Carretera (D.S. N° 033– 2001– MTC) Teórica La justificación se basa en el conocimiento científico actual sobre la producción de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica, destacando la importancia de utilizar fuentes renovables para reducir el impacto ambiental. Se resalta el potencial de la madera de molle como una fuente prometedora de biomasa y la necesidad de desarrollar tecnologías eficientes para su conversión en bioetanol. Tecnológica La investigación busca desarrollar tecnologías eficientes y sostenibles para convertir la madera de molle en bioetanol. Se enfoca en optimizar el proceso, garantizar escalabilidad y viabilidad comercial, gestionar subproductos y fomentar la innovación para superar desafíos técnicos y lograr una producción más eficiente y respetuosa con el medio ambiente. 1.5. Delimitantes de la investigación Teórico La investigación se encuentra dentro del estudio de la química orgánica (hidrólisis ácida), bioquímica (tratamiento enzimático) y transferencia de masa (destilación de etanol). 19 Temporal La investigación se programó para ser desarrollada en un período de 6 meses. Espacial La presente investigación se desarrolló específicamente en el Laboratorio de Investigación y Desarrollo de la empresa IMBAREX S.A. Lima – Perú 20 II. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes: internacional y nacional Internacional En el trabajo titulado “Obtención artesanal de bioetanol mediante desechos de la cáscara de plátano”. Los autores tuvieron como objetivo la obtención de alcohol orgánico, a partir de la fermentación alcohólica de biomasas residuales provenientes de una empresa que desecha cáscaras de plátano con diferentes grados de maduración, evaluaron la capacidad de las cáscaras de plátano como fuente de azúcares reductores necesarios para producir bioetanol. Se utilizó un diseño experimental factorial 3 x 2 para optimizar el contenido de alcohol. Se evaluaron dos niveles de madurez de las conchas de plátano residuales de la empresa S.A.S y tres cantidades diferentes de Saccharomyces cerevisiae (1, 5 y 10 g). El proceso incluyó el corte y la molienda de las conchas hasta lograr un tamaño de partícula de 2 mm, seguido de etapas de hidrólisis alcalina y ácida utilizando ácido sulfúrico y NaOH al 2% y 3%, respectivamente. La fermentación se llevó a cabo durante un período de 8 días, seguido de la filtración y destilación a 78°C. Los resultados de la investigación mostraron un contenido máximo de etanol de 7% v/v cuando se usaron cáscaras maduras y la mayor cantidad de Saccharomyces cerevisiae [4] En el trabajo titulado “Producción de bioetanol a partir de residuos de fruta utilizando Saccharomyces cerevisiae: una revisión de las diferentes condiciones y métodos de proceso” el autor tuvo como objetivo obtener etanol a partir de residuos de fruta en este artículo desarrollaron una revisión sistemática de la composición química, diferentes rutas de proceso y pretratamientos empleados sobre distintos desechos de fruta. Este estudio señala que los sustratos típicamente utilizados para la producción de bioetanol incluyen desechos de cáscaras de piña, banano y varios cítricos, entre los cuales la cáscara de musambi y pomelo exhiben los mayores rendimientos de etanol y 21 azúcares fermentables. Además, se indica que las condiciones óptimas para la hidrólisis ácida son bajas cargas de sustrato, concentraciones de H2SO4 inferiores al 0,5% (p/v) y tiempos de residencia menores a 15 minutos. Por otro lado, se encontró que el pretratamiento térmico en agua caliente, con un tiempo de residencia de 15 minutos y una temperatura de 121°C, favorece la hidrólisis enzimática. Como conclusión, el estudio sugiere que la producción de bioetanol a partir de residuos de frutas podría ser una solución viable para abordar la crisis ambiental y satisfacer la alta demanda energética. En el trabajo titulado “Obtención de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica presente en la cascarilla del arroz para ser utilizados en equipos motorizados” el autor tuvo como propósito obtener bioetanol a partir de la celulosa contenida en la cascarilla de arroz. El análisis de la materia prima reveló un contenido de humedad inicial de aproximadamente 13,99%, un tamaño de grano promedio de 1,40 mm y un contenido de cenizas del 20%. Durante la etapa de pretratamiento, se logró extraer la celulosa de la materia prima mediante un tratamiento químico que implicaba el uso de ácido sulfúrico al 0,4%, hidróxido de sodio al 20% y cloruro de sodio al 0,5%. Posteriormente, se calentó durante 1 hora a 40ºC y se dejó secar durante 24 horas en un horno industrial a 30ºC. Además, se evaluaron los procesos de hidrólisis ácida y enzimática para convertir la celulosa en azúcares reductores, utilizando una concentración de ácido sulfúrico al 2% para ambas hidrólisis, a una temperatura de 125ºC y 1 atmósfera de presión durante 3 horas. Se logró una conversión de azúcares del 70% para la hidrólisis ácida y del 85% para la hidrólisis enzimática. La fermentación alcohólica se llevó a cabo durante siete días, utilizando 22 Saccharomyces cerevisiae (levadura), y se obtuvo aproximadamente 29 mL de bioetanol. Finalmente, lograron obtener bioetanol a partir de la celulosa que contiene la cascarilla de arroz con características muy importantes para pensar en generar este alcohol en grandes cantidades [5] En el trabajo titulado "Producción de bioetanol a partir de residuos de frutas" el autor tuvo como objetivo principal la obtención de bioetanol utilizando residuos de frutas en lugar de cultivos destinados a la alimentación. Se utilizaron residuos de frutas obtenidos de un supermercado, específicamente cáscaras y pulpa de plátano, así como cáscaras de naranja. Estos residuos se sometieron a pretratamientos hidrotérmicos a diferentes temperaturas (120ºC, 128ºC y 135ºC) con el fin de determinar el proceso que maximiza la cantidad de azúcares fermentables extraídos. Se midió la concentración de compuestos inhibidores en los caldos obtenidos (furfural, HMF y ácido acético), los cuales pueden afectar negativamente el proceso de fermentación. Posteriormente, se realizó un ensayo de fermentación utilizando la pulpa de plátano. Durante este proceso de fermentación, se observó una disminución en la concentración de azúcares a medida que las levaduras producían etanol, alcanzando una concentración final de 1,69% (v/v) con un rendimiento de fermentación del 70% En el trabajo titulado “Estudio de la obtención de bioetanol a partir de diferentes de biomasa lignocelulósica, matriz de reacciones y optimización” el autor tuvo como objetivo detallar las reacciones químicas implicadas en la obtención de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica, así como llevar a cabo un estudio de caso sobre la optimización de su producción utilizando el software GAMS para modelar ecuaciones y sistemas. Utilizando este programa, se optimizó la producción de bioetanol considerando la composición en masa de la biomasa como variable clave. 23 En este caso de optimización se analizó la composición en masa de los componentes de varios tipos de biomasa lignocelulósica y se sometió a las etapas de pretratamiento, sacarificación y fermentación, donde tuvieron lugar una serie de reacciones químicas para producir el bioetanol y los subproductos [6] Nacional En el trabajo titulado “Influencia del tiempo, temperatura y dosis de reactivo en la concentración de glucosa en el pretratamiento ácido y alcalino de los residuos sólidos orgánicos”, los autores determinaron la influencia del tiempo, temperatura y dosis de reactivo en la concentración de glucosa en el pretratamiento ácido y alcalino de los residuos sólidos orgánicos. Determinaron condiciones óptimas para maximizar las concentraciones de glucosa, con la intención de valorizar los residuos sólidos orgánicos provenientes del comedor universitario. Utilizaron catorce tipos diferentes de estos residuos, que incluían apio, cebolla, col, coliflor, espinaca, lechuga, poro, zanahoria, zapallo, papa, alverja, mango, plátano y maíz morado. Estos residuos fueron sometidos a un proceso de secado a 60°C durante 24 horas, seguido de molienda. En las experimentaciones se emplearon 25 g de la mezcla de los residuos sólidos orgánicos. El procedimiento constó de dos etapas. La primera etapa, el pretratamiento ácido, se realizó durante 2, 3 o 4 horas, a temperaturas de 60°C, 70°C y 80°C, utilizando concentraciones de ácido sulfúrico de 0,1%; 2,5 % y 4% v/v, respectivamente. En la segunda etapa, el pretratamiento alcalino, se trabajó durante 2, 3 o 4 horas, a temperaturas de 70°C, 80°C y 90°C, utilizando soluciones de hidróxido de calcio de 0,05; 0,1 y 0,15 g/L, respectivamente. Luego, tomaron una mínima porción de los residuos sólidos orgánicos pretratados, los cuales fueron secados a 50°C durante 36 horas. La concentración de glucosa de residuos sólidos orgánicos después del pretratamiento ácido fue 12,8525 mg/mL a una temperatura de 60°C durante 2 horas, mientras para el 24 pretratamiento alcalino fue 18,0140 mg/mL a una temperatura de 80 ° C durante 4 horas [7] En el trabajo titulado “Obtención de bioetanol a partir de cáliz de aguaymanto” el autor tuvo como propósito identificar los parámetros óptimos para la producción de bioetanol a partir del cáliz de aguaymanto. La metodología incluyó la preparación del cáliz con diferentes concentraciones de hidróxido de sodio (NaOH) (10%, 15% y 20%), seguido de su hidrólisis en los pretratamientos, fermentación, destilación y medición del rendimiento de etanol en gramos por litro (g/L). De acuerdo con los resultados obtenidos, el pretratamiento más efectivo fue con una concentración del 20% de hidróxido de sodio (NaOH), lo que resultó en un porcentaje de cenizas de 1,95 ± 0,30; un porcentaje de fibra de 5,34 ± 0,44; una cantidad de azúcares reductores de 0,10 ± 0,0 mg/mL, y finalmente, se logró obtener 8,91 ± 0,83 g de etanol /L. El estudio permitió concluir que se logró obtener bioetanol a partir del cáliz de aguaymanto, donde la mejor concentración de Hidróxido de sodio (NaOH) fue la de 20%, porque tiene mejor efecto para hidrolizar la celulosa y obtener azúcares reductores; además el proceso de fermentación del hidrolizado del cáliz de aguaymanto para producir bioetanol se dio cuando los azúcares reductores formados por la hidrólisis del cáliz de aguaymanto fueron fermentados por las levaduras, obteniendo etanol hasta un máximo de 8,91 ± 0,83 g de etanol/L y este proceso de fermentación se dio en 15 días [8] En el trabajo titulado “Obtención de bioetanol a partir de cascarilla de cebada mediante hidrólisis ácida y fermentación”, el autor tuvo como objetivo producir bioetanol utilizando la cascarilla de cebada a través de procesos de hidrólisis ácida y fermentación. Durante la fase experimental, se logró obtener un grado de pureza de bioetanol del 30%. Para lograrlo, se llevaron a cabo dos etapas distintas. En la primera etapa, la hidrólisis ácida, se alcanzó la concentración máxima de azúcares fermentables (12,26 g/L) bajo las siguientes condiciones: una relación cascarilla/ácido de 1 a 10, una concentración de 25 ácido del 1%, una temperatura de 110°C y un tiempo de 210 minutos. La segunda etapa, la fermentación, produjo la concentración mínima de azúcares fermentables (3,62 g/L) con las siguientes condiciones: un pH de 4,8; una concentración de levadura de 10 g/L, una temperatura de 25°C y un tiempo de 48 horas. Finalmente, realizando el estudio estadístico de los datos obtenidos en proceso de hidrólisis y fermentación con el programa IBM SPSS Statistics 25 comprobaron la veracidad de los resultados obtenidos de forma experimental, garantizando la credibilidad del porcentaje de pureza del grado de etanol obtenido el cual fue del 30% [3] En el trabajo titulado “Capacidad de producción de bioetanol a través de la degradación de residuos sólidos orgánicos en Chiriaco, 2018.” El autor tuvo como objetivo de determinar la capacidad de producción de bioetanol a través de la degradación de residuos sólidos orgánicos en Chiriaco. La metodología consistió en obtener las muestras de residuos vegetales y de cocina para su posterior procesamiento en laboratorio. La secuencia fue la siguiente: pretratamiento, preparación de inoculo microbiano e inoculación, determinación de la glucosa formada, fermentación de la glucosa, destilación para obtener el alcohol etílico. La autora alcanzó resultados superiores en humedad, contenido de glucosa y otros azúcares reductores, así como en cantidad de bioetanol, y rendimiento en los residuos vegetales comparados con los residuos de cocina y el testigo. El ANVA realizado confirma esta superioridad, y confirma que la misma es estadísticamente válida. El estudio concluyó, que es técnicamente factible la producción de etanol a partir de estos residuos, sin embargo, es necesario abordar con mayor profundidad las condiciones óptimas para cada proceso con el fin de implementar dicha tecnología a nivel industrial [9] En el trabajo titulado “Estudio experimental de la obtención de bioetanol a partir de cáscara de plátano en Piura, Perú”, el autor tuvo como objetivo principal realizar un estudio experimental para la obtención de bioetanol a partir de la cáscara de plátano, 26 con la finalidad de brindar una oportunidad de negocio a las empresas productoras de chifles en la ciudad de Piura. Realizaron un análisis bibliográfico sobre el proceso de obtención de bioetanol, y las metodologías de recojo de información para la definición de los materiales, equipos, instrumentos y monitoreo de las principales variables de control. Finalmente, expusieron el método experimental y las técnicas que definieron el desarrollo y ejecución de las pruebas experimentales. La investigación presentó como resultado la obtención de bioetanol, incoloro y con una pureza de 95%, que sería propuesto para su aplicación en cocinas acondicionadas en la elaboración de chifles [10] 2.2. Bases teóricas 2.2.1. Biotecnología La Biotecnología se ha descrito como el empleo de organismos vivos o de sustancias derivadas de ellos con el fin de producir productos de utilidad para los seres humanos. Históricamente, la biotecnología ha sido utilizada en diversas aplicaciones [11] La biotecnología contemporánea abarca un conjunto diverso de metodologías derivadas de los avances en la investigación de la biología celular y molecular,las cuales pueden ser aplicadas en cualquier sector que haga uso de microorganismos o células. En años recientes, han surgido nuevas corrientes en el campo de la biotecnología, incluyendo enfoques hacia prácticas más ecológicas. Se define la biotecnología como el empleo de moléculas obtenidas de fuentes biológicas, así como estructuras celulares u organismos, con el propósito de llevar a cabo procesos específicos. Circunscribe la biotecnología al uso de agentes biológicos simples como las células vivas o muertas y componentes celulares excluyendo las aplicaciones de organismos complejos lo cual omite disciplina como la agricultura y la sostenía la cual no significa que la biotecnología no puede hacer importantes contribuciones en esta área la Federación europea de Biotecnología lo define como el uso integrado de la bioquímica, la microbiología y la 27 ingeniería genética para poder aplicar las capacidades de microorganismos, células cultivadas animales o vegetales o partes de los mismos en la industria, en la salud o en los procesos relacionados con el medio ambiente [11] 2.2.2. Materiales lignocelulósicos Los compuestos lignocelulósicos son altamente abundantes (Figura 1 Ver pag. Nº 29), por que forman parte de los residuos orgánicos de plantas cultivos y demás materia prima referente a frutas y verduras [12] Estos compuestos están caracterizados por presentar 3 capas en su composición celular, siendo la primera la lignina, cuya función es proteger la pared celular de la degradación química, la cual es difícil remover [6] La segunda capa está compuesta principalmente por hemicelulosa, la cual actúa también como protección de celulosa. La última capa es la que alberga la celulosa de la biomasa, la cual puede ser fermentable y producir etanol. 28 Figura 1 Composición de material lignocelulósico Pérez (2016) Debido a la composición de los materiales lignocelulósicos, la hidrólisis enzimática de esta biomasa se ve significativamente restringida por varios factores. Distintos estudios han llegado a la conclusión porque la cristalinidad de la celulosa es solo uno de ellos, mientras que otros incluyen el grado de polimerización, el contenido de humedad, la superficie de contacto disponible y el contenido de lignina. Para superar estas limitaciones y facilitar la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica, se han propuesto diversos pretratamientos. Estos pretratamientos pueden ser clasificados principalmente en físicos, como los mecánicos y térmicos, y químicos. A continuación, se detallarán las características de cada uno de estos métodos [8] 2.2.3. Pretratamiento de los materiales lignocelulósicos Los pretratamientos tienen como función la desintegración de la estructura molecular de los compuestos lignocelulósicos para facilitar la liberación de celulosa para su aprovechamiento en la fermentación (Figura 2 Ver pag. Nº 30). Este proceso se hace necesario debido a que la lignina y la hemicelulosa presentes en la composición celular de las plantas, forman una barrera contra el ataque enzimático, lo que imposibilita el 29 acceso a la celulosa [9] Figura 2 Representación esquemática del proceso de pretratamiento. Pérez (2016) Entre los objetivos fundamentales del pretratamiento de la biomasa lignocelulósica se pueden enumerar los siguientes: Reducir la cristalinidad de la celulosa, disociar el complejo lignina–celulosa, aumentar el área superficial del material, minimizar la presencia de sustancias que puedan dificultar las posteriores etapas de hidrólisis y fermentación, recuperar la mayor cantidad posible de azúcares hemicelulósicos y minimizar la pérdida del material original [4] Pretratamiento mecánico Consiste particularmente en el corte de la biomasa lignocelulósicos en pedazos más pequeños (Figura 3 Ver pag. Nº 31). El objetivo de un pretratamiento mecánico es la reducción en el tamaño de partículas, así como de la cristalinidad. La reducción de tamaño de las partículas conduce a un aumento de la superficie disponible y una reducción del grado de polimerización [13] El aumento de la superficie específica, la reducción del grado de polimerización y el 30 corte, son todos factores que aumentan el rendimiento de la hidrólisis total de la biomasa lignocelulósicos [13] Figura 3 Pretratamiento mecánico del material lignocelulósico Pérez (2016) Pretratamiento térmico Durante este pretratamiento la biomasa lignocelulósicos se calienta. Si la temperatura aumenta por encima de 150°C – 180°C, en primera instancia, la hemicelulosa y poco después la lignina, comenzará a solubilizarse. Esta temperatura de 180°C es probablemente sólo una indicación, porque la reactividad térmica de la biomasa lignocelulósicos depende en gran medida de su composición. Durante los procesos térmicos una parte de la hemicelulosa se hidroliza y forma ácidos. Estos mismos ácidos se supone siguen catalizando la hidrólisis de la hemicelulosa [13] Pretratamiento con vapor de agua Durante el pretratamiento con vapor la biomasa se pone en un recipiente grande, a altas temperaturas (hasta 240°C) y presión, durante unos minutos. Después de una serie tiempo, el vapor se libera y la biomasa se enfría rápidamente. El objetivo de un 31 pretratamiento con vapor o de explosión con vapor es solubilizar la hemicelulosa y así tener mejor acceso para la hidrólisis enzimática de la celulosa evitando la formación de los inhibidores. La diferencia entre el pretratamiento con vapor y la explosión con vapor, es que en este último hay una despresurización rápida y refrigeración de la biomasa al final del pretratamiento, lo que hace que el agua de la biomasa explote el material [14] Pretratamiento con agua caliente En este caso el agua se encuentra líquida, el objetivo del pretratamiento es solubilizar principalmente la hemicelulosa para tener mejor acceso a la celulosa y evitar la formación de inhibidores. Para evitar la formación de inhibidores, el pH debe mantenerse entre 4 y 7 durante el pretratamiento. Mantener este rango de pH minimiza la formación de los monosacáridos, y por lo tanto también la formación de productos de degradación que pueden seguir catalizando la hidrólisis del material celulósico durante el pretratamiento [14] Pretratamiento ácido El pretratamiento de la biomasa lignocelulósicos con ácidos a temperatura ambiente se realiza para mejorar la digestibilidad anaerobia. El objetivo es solubilizar la hemicelulosa, y lograr con esto mejor acceso a la celulosa. El pretratamiento se puede hacer con ácidos diluidos o con ácidos fuertes; la principal reacción que se produce durante el pretratamiento ácido es la hidrólisis de la hemicelulosa, especialmente de xilano que es relativamente estable en ácido. La hemicelulosa solubilizada en medio ácido puede ser objeto de las reacciones hidrolíticas y producir furfural, HMF y otros productos [15] Pretratamiento alcalino Durante el pretratamiento alcalino las primeras reacciones que tienen lugar son la solvatación y saponificación (Figura 4 Ver pag. Nº 33). Esto provoca que la biomasa se expanda, lo cual la hace más accesible a las enzimas y bacterias. En altas 32 concentraciones alcalinas, ocurre una hidrólisis alcalina, lo cual conlleva a la degradación y descomposición de polisacáridos. En consecuencia, se observa que la biodegradabilidad de la biomasa lignocelulósicos está limitada por varios factores como la cristalinidad de la celulosa, el área superficial y el contenido de lignina. Los pretratamientos pueden tener efecto en uno o más de estos aspectos y algunos pueden considerarse más favorables que otros [15] Figura 4 Pasos para obtención de etanol Pérez (2016) Una vez realizado el pretratamiento se obtienen dos fracciones: una fracción sólida insoluble en agua la cual contiene celulosa y lignina; la otra fracción es líquida compuesta de hemicelulosa. Posteriormente se realiza la hidrólisis de cada una de las fracciones (celulósica y hemicelulosa) para obtener los monómeros; hexosas y pentosas respectivamente los cuales son la materia prima de diferentes productos químicos dentro de los cuales se encuentra el etanol. 33 2.2.4. Proceso de obtención de alcohol orgánico a partir de material lignocelulósico Las técnicas de producción han evolucionado con el paso de los años, en donde pueden distinguirse dos generaciones de producción de bioetanol. La primera generación se basa en aprovechar los azucares y almidón presente principalmente en la caña de azúcar y el maíz, mientras que en la segunda generación de combustibles se utilizan los residuos de cultivos alimentarios (Figura 5) [3] Figura 5 Generaciones de producción de etanol. Quintero (2009) Cualquier residuo vegetal puede ser transformado en azúcar y posteriormente ser convertido en bioetanol. Por otra parte, la celulosa no se considera para uso alimentario, por lo que la posibilidad de su aprovechamiento es amplia y es considerada una fuente óptima de materia prima para la producción de combustibles de forma sustentable [3] La producción de bioetanol a partir de material lignocelulósico es el más complejo de los procesos (Figura 6 Ver pag. Nº 35) La biomasa lignocelulósicos no sólo tiene sus azúcares formando polímeros como la celulosa y hemicelulosa, sino que también 34 contiene lignina, un polímero complejo de origen aromático entrelazado con la celulosa y hemicelulosa. Por lo tanto, es necesaria una etapa de pretratamiento para hidrolizar la hemicelulosa, así como para remover la lignina y dejar la superficie celulósica expuesta al ataque enzimático. En estas etapas de pretratamiento, existe una gran variedad de opciones, desde tratamientos químicos, físicos, fisicoquímicos o biológicos. Luego, la celulosa es hidrolizada por enzimas específicas a azúcares que serán fermentados a etanol [3] Figura 6 Modelo de producción de bioetanol a partir de material lignocelulósico. Rocamora (2009) Proceso de hidrólisis Segunda etapa del proceso de pretratamiento que consiste en romper los carbohidratos complejos en azúcares simples para utilizarlos como sustrato en la posterior fermentación. La celulosa se hidroliza en monosacáridos de D– glucosa, mientras que la hemicelulosa lo hace en pentosas y hexosas (manosa, glucosa, xilosa, etc.). En la Figura 7 (Ver pag. Nº 36) se muestra un esquema del efecto que tiene la hidrólisis en los 35 carbohidratos [16] Figura 7 Representación esquemática del proceso de hidrólisis. Pérez (2016) Proceso de fermentación La fermentación alcohólica, fermentación etílica, o del etanol, es un proceso de tipo biológico, en el cual se lleva a cabo una fermentación anaerobia, es decir, sin presencia de oxígeno. Este tipo de fermentación se debe a la actividad de microorganismos especiales que convierten azúcares, como la glucosa, la fructosa, etc. a etanol (Figura 8 Ver pag. Nº 37) Cuando la fermentación se emplea en el proceso de producción de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica, los azúcares liberados durante la hidrólisis enzimática son fermentados con la consiguiente producción de etanol y CO2. La conversión estequiométrica de la glucosa y la xilosa a etanol es de aproximadamente 0,51 g de etanol por gramo de azúcar. Estos resultados son variables según el método que se emplee, el microorganismo, condiciones de temperatura, el tipo de biomasa, etc. [16] Para la selección óptima de microorganismos debe considerarse que presenten altas conversiones, tolerancia alcohólica y un rango amplio de sustratos utilizables [13] 36 Figura 8 Esquema del proceso de fermentación para la producción de bioetanol a partirde biomasa lignocelulósica. Nota : 1: Biorreactor, 2: Filtro de membrana, 3: Decantador, 4: Unidad de evaporacióninstantánea, X: Células, S1: Glucosa, S2: Xilosa, P: Etanol en la fase acuosa, P –: Etanol en la fase solvente, E: Solvente. Gutiérrez (2005) Proceso de destilación El proceso de destilación es el método por el que se separa el etanol del agua debido a la mayor volatilidad del etanol. A presión atmosférica las temperaturas de ebullición son 78,2°C y 100ºC para el etanol y el agua respectivamente, por lo que para separar ambos compuestos se realizan destilaciones sencillas repetidas (Figura 9 Ver pag. Nº 38). Para ello, durante el proceso se va obteniendo un vapor que es cada vez más rico en el componente más volátil (el etanol), que se vuelve a destilar sucesivamente [17] 37 Figura 9 Esquema del proceso de la deshidratación del etanol por destilación azeotrópica Revista ingeniería e investigación (2004) De este modo, la fracción líquida se va enriqueciendo progresivamente con etanol. Cuando en la mezcla se alcanza el punto del azeótropo, la mezcla no se puede destilar más. Para obtener alcohol al 100% es necesario romper el azeótropo lo que resulta un proceso complejo y caro, existiendo varias técnicas. Para lograrlo se puede emplear un tercer componente, generalmente benceno, para alterar la relación de la tensión de vapor del azeótropo. En el caso del bioetanol resulta más útil emplear el alcohol sin deshidratar o usar emulsiones para mezclarlo con gasolina [17] 2.3. Marco conceptual 2.3.1. Molle El área de distribución natural es la región de los Andes, principalmente Perú. Se encuentra en altitudes de hasta 3 900 msnm, en áreas con 300–700 mm de lluvia/año. Tolera altas temperaturas y una vez establecido es extremadamente resistente a la sequía; es resistente a las heladas, pero no por períodos prolongados. Una especie pionera de crecimiento rápido que se encuentra típicamente en áreas perturbadas con 38 crecimiento secundario, bordes de caminos y tierras agrícolas. Crece bien en sitios pedregosos y laderas (Figura 10) Figura 10 Molle (Schinus molle) Robles (2014) Prefiere suelos arenosos y bien drenados, pero tolera la mayoría de los tipos de suelo y también la salinidad y la alcalinidad. Introducido en América central y del Norte, Europa y África y en algunos lugares se ha naturalizado [18] Todas las partes del árbol tienen un alto contenido de aceite esencial. Tiene una larga historia de usos medicinales en América del Sur y Central y aún hoy en día los herbolarios lo usan, especialmente para infecciones virales y bacterianas. La madera se utiliza para leña y carbón; es moderadamente duro y pesado con una densidad (secado al aire) de 0,54 – 0,68 g/cm3, fácil de trabajar, duradero y resistente a las termitas y, por lo tanto, adecuado para postes. La resina se utiliza como masilla, el látex se produce a partir de muchas partes del árbol, los frutos producen jugo y las semillas se utilizan 39 como sustituto de la pimienta. Se planta para conservación de suelos, mejoramiento de suelos, cortavientos, sombra y como ornamental. Aunque el árbol es de hoja perenne y conserva alrededor del 75% de su follaje durante todo el año, las hojas caídas, las ramas y los frutos contribuyen significativamente al suelo [19] 2.3.2. Hidrólisis La hidrólisis es una reacción química en la que moléculas de agua (H2O) se dividen en sus átomos componentes (hidrógeno y oxígeno). A su vez, en el proceso de hidrólisis, los átomos que componen las moléculas de agua pasan a formar enlaces químicos con la sustancia que reacciona con el agua. La hidrólisis es una reacción muy importante, pues el agua es el disolvente más usado mundialmente. El nombre específico de esta reacción proviene de los vocablos griegos hydro (“agua”) y lisis (“ruptura”), de donde se desprende que es una forma de ruptura de una molécula determinada de soluto, cuando la hace reaccionar con agua. En términos de química orgánica, se trata del proceso exactamente opuesto a la reacción de condensación, que es la combinación de dos moléculas orgánicas, en las que se obtiene un producto y una molécula de agua [5]. Existen diversas formas de hidrólisis, dependiendo de las sustancias que se hacen reaccionar con el agua [3] Hidrólisis ácido–base En esta reacción el agua se divide en un ion hidroxilo (OH–) y un protón (H+), que es inmediatamente hidratado para formar un ion hidronio (H3O+). Así, el agua pura manifiesta esta reacción espontáneamente. H2O ⇔ OH–+H+ H2O+H+ ⇔ H +3O Cuando se añaden determinadas sustancias al agua se puede modificar el equilibrio de la reacción anterior. Por ejemplo, si añadimos sales, dependiendo de su solubilidad, sus aniones o cationes se pueden combinar con los iones OH– y H3O+, lo que puede 40 provocar que varíe el pH de la disolución final. Así, existen cuatro clasificaciones para la hidrólisis ácido–base según el tipo de sal que se añada al agua: Hidrólisis de sal de ácido fuerte–base fuerte Cuando se diluye una sal proveniente de un ácido y una base fuerte en agua, no se produce casi hidrólisis, debido a lo que no se altera el equilibrio de disociación del agua. El pH en este caso será neutro. Por ejemplo: HCl + NaOH → NaCl + H2O fuerte base fuerte sal NaCl + H2O → Na+ –(ac) + Cl ( ac) Hidrólisis de sal de ácido débil–base fuerte. Se combinan el anión de la sal (proveniente del ácido débil y la base fuerte) y un protón del agua. Liberando iones hidroxilo, debido a lo que el pH resultante será básico. Por ejemplo: CH3COOH (ac) + NaOH (ac) → CH3COONa(ac) + H2O acido débil base fuerte sal CH COONa + H O → CH COO– +Na+ –3 (ac) 2 3 CH3CO(aOc) + H(a2cO) ⇔ CH3COOH – (ac) +OH (ac) (ac) Hidrólisis de sal de ácido fuerte–base débil El catión de la sal (proveniente de ácido y la base) cede un protón al agua para formar un ion hidronio (H3O+), debido a lo que el pH resultante será ácido. Por ejemplo: HCl(ac) + NH3(ac) → NH4Cl (ac) acido fuerte base débil sal NH Cl +H O → NH + + Cl– 4 (ac) 2 4 (ac) (ac) NH + + 4 (ac) + H2O ⇔ NH3(ac) + H3O (ac) 41 Hidrólisis de sal de ácido débil–base débil. El catión de la sal (proveniente de la base débil) se combina con el agua liberando un ion hidronio (H3O+) y el anión de la sal (proveniente del ácido débil) se combina con el agua liberando un ion hidroxilo (OH–). El pH resultante dependerá de las cantidades de iones hidronio e hidroxilo producidos. Si se produce más ion H3O+ que ion OH–, el pH será ácido, y si se produce más ion OH– que ion H3O+, el pH será básico. Por otra parte, si las cantidades producidas de ambos iones son iguales, el pH resultante será neutro. Por ejemplo: CH3COOH(ac)+ NH3 (ac) → CH3COONH4(ac) acido débil base débil sal NH + 4 (ac) + H2O ⇔ NH +H +3(ac) 3O (ac) CH3COO–(a c) + H2O ⇔ CH –3COOH(ac) +OH(a c) Hidrólisis de amidas y ésteres. En estos tipos de sustancias orgánicas, la hidrólisis puede ocurrir en medio ácido o básico. En el caso de los ésteres, se hidrolizan en medio ácido (1) y básico (2), generando ácidos carboxílicos y alcoholes. El proceso de hidrólisis de ésteres también se denomina saponificación (hidrólisis de triglicéridos para obtener jabones). Por otra parte, las amidas generalmente se hidrolizan en medio ácido, descomponiéndose en aminas y ácidos carboxílicos. O O II H2O II _ _ CH3 C OCH3 → CH _ C_3 OH + CH3OH (1) éster H+ ácido carboxílico alcohol O O II H2O II _ _ CH3 C OCH3 → CH _ _ –3 C O + CH3OH (2) 42 O O II H2O II CH _ C _ NH_ CH3 → CH _ _3 3 C OH + CH3NH2 amida H+ ácido carboxílico amina Hidrólisis de polisacáridos Los polisacáridos (azúcares) pueden hidrolizarse y descomponerse (rompiendo sus enlaces glucosídicos, que son enlaces entre monosacáridos para formar polisacáridos) en polisacáridos más simples, en disacáridos o en monosacáridos. En el proceso de hidrólisis un hidrógeno de la molécula de agua se enlaza al oxígeno del extremo de una molécula de azúcar, mientras que el hidroxilo se enlaza al extremo del resto. La hidrólisis de polisacáridos es un proceso llevado a cabo regularmente por las formas de vida. Sacarosa glucosa fructuosa Hidrólisis enzimática. Es la hidrólisis que se produce en presencia de enzimas (compuestos orgánicos que generalmente aumentan la velocidad de las reacciones químicas) llamadas hidrolasas. Por ejemplo, la urea amidohidrolasa es una enzima que intervienen en la hidrólisis de la urea. O II H20 H2N _ C _ NH2 → CO + + 2NH3 2 Urea 2.3.3. Fermentación Se llama fermentación a un proceso de oxidación incompleta que no requiere de oxígeno para tener lugar y que produce una sustancia orgánica como resultado. Es un 43 proceso de tipo catabólico, es decir, de transformación de molécula compleja a molécula sencilla y generación de energía química en forma de ATP (Adenosin,Trifosfato).La fermentación consiste en un proceso de glucolisis (ruptura de la molécula de glucosa) que produce piruvato (ácido pirúvico) y que al carecer de oxígeno como receptor de los electrones sobrantes del NADH producido (nicotin adenin dinucleótido), emplea para ello una sustancia orgánica que deberá reducirse para reoxidar el NADH a NAD+, obteniendo finalmente un derivado del sustrato inicial que se oxida. Dependiendo de dicha sustancia final, habrá diversos tipos de fermentación. Este proceso fue descubierto por el químico francés Louis Pasteur, quien lo calificó como “La vida sin aire” (La vie sans l’air), porque puede ser llevado a cabo en ausencia de oxígeno por microorganismos como las bacterias, levaduras, o algunos metazoos y protistas. En este proceso, entonces, no intervienen ni las mitocondrias ni las estructuras vinculadas al proceso de respiración celular [1] En comparación con la respiración aerobia, la fermentación no es un método de obtención de energía muy eficaz: se producen solo 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa consumida, mientras que al respirar se obtienen de 36 a 38. Sin embargo, este proceso es llevado a cabo por diversas células de nuestro cuerpo para cubrir los instantes de ausencia de oxígeno, como ocurre en las células musculares que fermentan glucosa cuando el insumo de oxígeno no es suficiente para continuar respirando [3] 2.3.4. Tipos de fermentación Fermentación alcohólica Es un proceso llevado a cabo por las levaduras principalmente, en el que, a partir de ciertos azúcares, se produce una cantidad de alcohol etanol, dióxido de carbono y ATP. Este es el proceso empleado para producir las bebidas alcohólicas. Fermentación acética Propia de las bacterias del género Acetobacter, transforma el alcohol etílico en ácido 44 acético, o sea, el alcohol en vinagre. Es, no obstante, un proceso aeróbico, por lo que puede darse en los vinos expuestos al aire. Fermentación láctica Consiste en una oxidación parcial de la glucosa, llevada a cabo por bacterias lácticas o por las células musculares animales (cuando se quedan sin oxígeno para respirar). Este proceso genera ATP, pero produce ácido láctico como subproducto, lo cual produce al acumularse, la sensación dolorosa de fatiga muscular. Fermentación butírica Consiste en la conversión de la glucosa en ácido butírico y gas, esto último le confiere un olor típicamente desagradable. Es llevada a cabo característicamente por las bacterias del género Clostridium y requiere la presencia de lactosa. Fermentación butanodiólica Se trata de una variante de la fermentación láctica, llevada a cabo por enterobacterias que liberan dióxido de carbono y generan butanodiol, un alcohol incoloro y viscoso. Fermentación propiónica En este proceso intervienen el ácido acético, el dióxido de carbono y el ácido succínico. Se obtiene de todos ellos ácido propiónico, una sustancia corrosiva con olor acre. 2.4. Definición de términos básicos Bioetanol Es un biocombustible obtenido a partir de la fermentación de materia orgánica rica en azúcares, éstos pueden encontrarse de manera directa en el jugo de diversas frutas y verduras. Celulosa Es un carbohidrato complejo que consta de más de 3000 unidades repetitivas de 45 glucosa. Es el componente estructural básico de las paredes celulares de las plantas (no digeribles por el hombre) Glucosa La glucosa es un monosacárido, un tipo de azúcar simple, de color blanco, cristalina, soluble en agua y muy poco en el alcohol, que se halla en las células de muchos frutos, miel, sangre y líquidos tisulares de animales. Levadura Se llama levadura o fermento a un conjunto de diversos hongos, por lo general microscópicos y unicelulares, capaces de iniciar los procesos de descomposición (fermentación) de distintas sustancias orgánicas, particularmente los azucares y los carbohidratos y obtener como subproducto otras sustancias especificas (alcoholes). Lignina Es uno de los polímeros más abundantes en la naturaleza y está presente en la pared celular. El objetivo principal de la lignina es dar a la planta el soporte estructural, impermeabilidad, y la resistencia contra el ataque microbiano y el estrés oxidativo. Saccharomyces cerevisiae Es una levadura que constituye el grupo de microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad; su nombre deriva del vocablo Saccharo (azúcar), myces (hongo) y cerevisiae (cerveza). Es una levadura heterótrofa, que obtiene la energía a partir de la glucosa y tiene una elevada capacidad fermentativa. Puede aislarse con facilidad en plantas y tierra, así como del tracto gastrointestinal y genital humano. 46 III. HIPÓTESIS Y VARIABLES 3.1. Hipótesis (general y específicas) General Las condiciones más favorables para la obtención de bioetanol a partir de la fibra de molle son el adecuado control de la hidrólisis ácida y la fermentación. Específicas a) Las condiciones favorables en la hidrólisis se encontrarán en los siguientes rangos: Concentración de ácido: 1% a 4%, temperatura: 100°C a 120°C y tiempo: 180 a 240 min b) Las condiciones favorables en la fermentación se encontrarán en los siguientes rangos: Concentración de levadura: 5 a 10 g/L, temperatura: 20°C a 30°C y tiempo: 24 a 48 h 3.1.1. Operacionalización de variable Variable dependiente (Y): Obtención de bioetanol Variable independiente 1 (X1): Hidrólisis ácida Variable independiente 2 (X2): Fermentación alcohólica Es decir: Y = f (X1, X2). La Figura 11 muestra la relación entre las variables: Figura 11 Relación de las variables de la investigación. Y = Condiciones favorables para la obtención de bioetanol a partir de molle (Schinus molle) a nivel de laboratorio X1= Condiciones favorables de hidrólisis de la fibra de molle X2= Condiciones favorables de fermentación de azúcares provenientes de la hidrólisis 47 En la Tabla 1 se presenta la operacionalización de las variables de investigación. Tabla 1 Operacionalización de variables VARIABLE DEPEND. DIMENSIONES INDICADORES MÉTODO Y = Condiciones favorables para la – Eficiencia de los procesos – Porcentaje de etanol - Cuantificación del volumen de obtención de bioetanol a partir de de obtención de bioetanol obtenido (valor máximo) etanol por destilación del molle (Schinus molle) a nivel de fermentado laboratorio - Análisis estadístico VARIABLES INDEPEND. DIMENSIONES INDICADORES MÉTODO X1= Condiciones favorables de hidrólisis – Eficiencia de la hidrólisis - Concentración de ácido - Pruebas experimentales la fibra de molle ácida - Temperatura de hidrólisis - Cuantificación de azúcares - Tiempo de hidrólisis fermentables mediante espectrofotometría uv–vis X2= Condiciones favorables de – Eficiencia de la - Concentración de levadura – Pruebas experimentales fermentación de azúcares fermentación de azúcar - Temperatura de provenientes de la hidrólisis fermentación - Tiempo de fermentación 48 IV. METODOLOGÍA DEL PROYECTO 4.1. Diseño metodológico Por la naturaleza de los datos (enfoque): Investigación cuantitativa Esta investigación se considera así debido a su enfoque en la recopilación y el análisis de datos numéricos y medibles para responder a la pregunta de investigación. El diseño se centra en la manipulación de variables como la temperatura de hidrólisis, el tiempo de hidrólisis y la concentración de ácido, con el objetivo de determinar su impacto en el rendimiento de bioetanol. Además, se usaron técnicas estadísticas para analizar la relación entre estas variables y el resultado esperado. Por el nivel de investigación: Investigación correlacional (causa–efecto) Se busca establecer relaciones de causa y efecto al manipular las variables independientes. El enfoque se centró en identificar cómo las variaciones en las condiciones de experimentación afectan directamente la producción de bioetanol. 4.2. Método de investigación Primera etapa Se colectó la materia prima, proveniente de la ciudad de Huancayo (Figura 12 Ver pag. Nº 50) Posteriormente, se acondicionó la materia prima para las pruebas. Se retiró la corteza y se ralló la madera (Figura 13 Ver pag. Nº 50), para que la disminución del tamaño de partícula favorezca tanto la hidrólisis ácida, como la enzimática. Finalmente, se procedió a secar la madera rallada en estufa a 45°C por 24 horas (Figura 14 Ver pag. Nº 51) 49 Figura 12 Materia prima utilizada en la investigación Figura 13 Acondicionamiento de la materia prima 50 Figura 14 Secado de la materia prima Las muestras acondicionadas fueron sometidas a hidrólisis ácida en un recipiente cerrado. Los experimentos se realizaron en base al diseño mostrado en la Tabla 2. Tabla 2 Diseño experimental para las pruebas de estudio de las condiciones de hidrólisis Tiempo de Concentración de ácido (%)T emperatura de Prueba hidrólisis hidrólisis (°C) (min) 1 1 100 180 2 2 100 180 3 4 100 180 4 1 120 180 5 2 120 180 6 4 120 180 7 1 100 240 8 2 100 240 9 4 100 240 10 1 120 240 11 2 120 240 12 4 120 240 51 Para ello, se prepararon soluciones de ácido sulfúrico al 1%, 2% y 4%. Para cada prueba se tomaron 250 g de muestra acondicionada y se pusieron en contacto con 500 mL de la solución ácida, de acuerdo al caso (Figura 15) Figura 15 Hidrólisis ácida de las muestras de molle Las muestras fueron calentadas a temperatura constante de 100°C y 120°C, de acuerdo al caso, para favorecer la hidrólisis (entre 180 y 240 minutos). Se hizo el control de temperatura durante todo el proceso (Figura 16 Ver pag. Nº 53) Posteriormente se hicieron las pruebas de verificación de azúcares fermentables, para conocer si realmente fue efectiva la hidrólisis ácida. Para ello se utilizó el método DNS, que consistió en el siguiente procedimiento: a) Preparación del reactivo DNS.- Se disolvieron 1,5 g de hidróxido de sodio en 50 mL de agua. Seguidamente, se añadieron 44g de tartrato de sodio y potasio hasta disolución y finalmente se agregó 1 g de ácido 3,5 – dinitrosalicílico (DNS). Se enrasó a 100 mL y se almacenó el reactivo en un frasco ámbar [20] b) Preparación de los puntos de la curva de calibración.- Se prepararon 5 puntos 52 para la curva de calibración, con un estándar de glucosa para las siguientes concentraciones: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; y 2 g/L. La preparación se realizó en tubos de ensayo recubiertos con papel aluminio para evitar reacciones con la luz ultravioleta. La cantidad de cada reactivo utilizado en los tubos de ensayo se muestra en la Tabla 3 (Ver pag. Nº 54) [20] Figura 16 Preparación de las muestras para la hidrólisis ácida 53 Tabla 3 Preparación de la curva de calibración para la cuantificación de azúcares fermentables Concentración (g/L) Reactivo (ml) 0 0,5 1 1,5 2 Glucosa 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Agua destilada 2,75 2,50 2,25 2,00 1,75 DNS 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 c) Construcción de la curva de calibración.- Se realizó la lectura de la absorbancia de los puntos de la curva antes preparados. Para este trabajo se utilizó una longitud de onda de 540 nm [20] d) Preparación de las muestras para la lectura,. Se tomó una pequeña muestra del líquido de hidrólisis de 0,25 mL de cada prueba y se hicieron reaccionar con 0,25 mL del reactivo DNS. Esto se hizo en tubos de ensayo envueltos en papel aluminio. Luego se hizo la lectura de la muestra a la misma longitud de onda y se hizo los cálculos respectivos con la curva de calibración ya elaborada [20] Segunda etapa A las muestras hidrolizadas se sometieron a fermentación. Para evaluar la eficiencia de fermentación se tomaron 200 mL del lixiviado y se agregaron 0,25 g/L de levadura Saccharomyces cerevisiae (Figura 17 Ver pag. Nº 55) y a otros 200 mL se le agregaron 0,5 g/L. Además, se agregó 0,25 g/L de sulfato de magnesio, para el funcionamiento óptimo de la levadura y 1 g/L de fosfato de amonio con 0,5 g/L de urea, para ajustar el 𝑝𝐻 hasta 5, en todas las muestras. La fermentación se realizó durante 48 h, y se dio a una temperatura promedio de 25°C. 54 Figura 17 Levadura utilizada para la fermentación Posteriormente, se filtraron las muestras fermentadas, con un filtro acoplado a una bomba de vacío, a través de papel de filtro (Whatman 42). El filtrado se destiló mediante un montaje de destilación de laboratorio de vidrio, a 80°C en todos los casos. Los destilados obtenidos se almacenaron en recipientes de vidrio y se les midió el índice de refracción, para poder determinar el contenido en volumen de alcohol. Esto fue posible porque se preparó una curva de calibración previamente, en la que se utilizaron soluciones con distinta concentración de etanol, que sirvieron como puntos para la curva, y se muestran en la Tabla 4 (Ver pag. Nº 56) [21] 55 Tabla 4 Preparación de la curva de calibración para la determinación del contenido de alcohol Concentración de etanol (%) Índice de refracción 10 1,338 30 1,354 50 1,357 70 1,363 90 1,365 Tercera etapa Se analizó la información obtenida en las etapas anteriores y se realizó la optimización estadística, a través del software Minitab. 4.3. Población y muestra La población está constituida por madera de molle (Schinus molle) de la ciudad de Huancayo, capital de la región Junín. Para cada prueba experimental se utilizaron 250 g de madera de molle. 4.4. Lugar de estudio y período desarrollado Laboratorio de Investigación y Desarrollo de la empresa IMBAREX S.A. Lima – Perú, entre noviembre de 2023 y febrero de 2024. 4.5. Técnicas e instrumentos para la recolección de la información Las técnicas de análisis que utilizadas fueron las siguientes: Hidrólisis química: Procedimiento mostrado en “Uso de reactivo de ácido dinitrosalicílico para la determinación de la reducción de azúcar”. [10] 56 Hidrólisis enzimática Procedimiento mostrado en “Estudio experimental de la obtención de bioetanol a partir de la cáscara de plátano en Piura, Perú”. [10] Determinación del contenido de alcohol Procedimiento mostrado en “Métodos ópticos de análisis” [10]. Los instrumentos insumos utilizados fueron los siguientes: Espectrofotómetro UV–VIS Refractómetro Plancha eléctrica Balanza analítica Termómetro Balón fondo redondo de 3 bocas Picnómetro Equipo de destilación Insumos químicos Ácido sulfúrico concentrado (98%) Ácido 3,5 – dinitrosalicílico Hidróxido de sodio Tartrato de sodio y potasio Sulfato de magnesio Fosfato de amonio Urea Levadura Saccharomyces cerevisiae (Marca Mauripan) Glucosa Etanol Agua destilada 4.6. Análisis y procesamiento de datos Los datos recopilados durante la investigación fueron cuidadosamente procesados y 57 analizados utilizando el método de superficie de respuestas y gráficos de contornos a través del uso de software especializado (Minitab). El método de superficie de respuestas es una herramienta poderosa que nos permitió modelar y visualizar la relación entre múltiples variables y la respuesta deseada, en este caso, la obtención de azúcares fermentables a partir de madera de molle. Mediante la construcción de las superficies de respuestas y gráficos de contornos, podremos visualizar cómo los cambios en las variables independientes, como la concentración de levadura, el tiempo de reacción y la temperatura, afectan la producción de bioetanol. Esto nos permitió identificar las condiciones óptimas para obtener el mayor rendimiento de bioetanol a partir de la biomasa de molle. Además, se presentan los resultados del análisis de varianza (ANOVA) de las optimizaciones. El análisis de varianza nos permitió evaluar la significancia estadística de las diferencias entre los grupos de datos y determinar qué variables tuvieron un impacto más significativo en la obtención de bioetanol. Esto nos proporcionó información importante para la toma de decisiones y la identificación de factores clave que influyen en el proceso. La combinación del método de superficie de respuestas, los gráficos de contornos y el análisis de varianza nos brindó una comprensión integral de las condiciones óptimas para obtener bioetanol a partir de madera de molle, lo que resultó en un enfoque más eficiente y sostenible para la producción de este valioso biocombustible. 4.7. Aspectos éticos en investigación La investigación tiene como objetivo salvaguardar los derechos de autor de los distintos trabajos que sirven como base teórica para la investigación. Este compromiso se fundamenta en el Código de Ética de Investigación – 2019, proporcionado por el Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional del Callao. El respeto a la 58 propiedad intelectual y el reconocimiento adecuado de las fuentes utilizadas son principios fundamentales para mantener la integridad académica y científica de la investigación. Se garantiza la correcta cita y referencia a los trabajos consultados, asegurando así la transparencia y el cumplimiento ético en el uso de la información. 59 V. RESULTADOS 5.1. Resultados descriptivos A continuación, se muestran los resultados obtenidos en las pruebas experimentales. En la Tabla 5 se muestran los resultados de la hidrólisis ácida, en términos de la cantidad de azúcares fermentables. Tabla 5 Resultados de la hidrólisis ácida Prueba Concentración de Temperatura de Tiempo de Absorbancia Cantidad de ácido (%) hidrólisis (°C) hidrólisis azúcares (min) fermentables (g/L) 1 1 100 180 0,67 1,16 2 2 100 180 0,70 1,21 3 4 100 180 0,72 1,24 4 1 120 180 0,97 1,66 5 2 120 180 1,07 1,82 6 4 120 180 1,03 1,76 7 1 100 240 0,78 1,34 8 2 100 240 0,80 1,37 9 4 100 240 0,79 1,36 10 1 120 240 1,12 1,91 11 2 120 240 1,16 1,97 12 4 120 240 1,15 1,96 En las Tablas 6 (Ver pag. Nº 61) y 7 (Ver pag. Nº 62) se muestran los resultados de la concentración de bioetanol obtenidos en cada prueba, cuando se trabajó con 0,25 y 0,5 g/L para la concentración de la levadura, respectivamente. 60 Tabla 6 Resultados del índice de refracción y de la concentración de bioetanol obtenido para la fermentación con 0.25 g/L de Saccharomyces Cerevisiae Prueba Concentración de Índice de Concentración de levadura refracción bioetanol (g/L) (%) 1 1,345 23,67 2 1,343 20,33 3 1,344 22,00 4 1,348 28,67 5 1,347 27,00 6 1,348 28,66 0,25 7 1,345 23,67 8 1,344 22,00 9 1,342 18,65 10 1,351 33,67 11 1,352 35,33 12 1,350 32,00 Figura 18 Concentración de bioetanol (%) obtenido de la fermentación para cada prueba con 0,25 g/L de levadura Saccharomyces cerevisiae Concentración de bioetanol (%) Concentración de bioetanol (%) 35.33 33.67 32 28.67 28.66 27 23.67 23.67 22 22 20.33 18.65 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 61 Tabla 7 Resultados del índice de refracción y de la concentración de bioetanol obtenido para la fermentación con 0.5 g/L de Saccharomyces Cerevisiae Prueba Concentración de Índice de Concentración de levadura (g/L) refracción bioetanol (%) 1 1,348 28,67 2 1,346 25,33 3 1,349 30,32 4 1,352 35,33 5 1,352 35,33 6 1,353 37,00 0,5 7 1,347 27,00 8 1,348 28,67 9 1,352 35,33 10 1,353 37,00 11 1,354 38,67 12 1,353 37,00 Figura 19 Concentración de bioetanol (%) obtenido de la fermentación para cada prueba con 0,5 g/L de levadura Saccharomyces cerevisiae Concentración de bioetanol (%) Concentración de bioetanol (%) 38.67 37 37 37 35.33 35.33 35.33 30.32 28.67 28.67 27 25.33 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 62 5.2. Resultados inferenciales Para conocer las condiciones más adecuadas de hidrólisis, se optimizó por medio de la superficie de respuesta la concentración del ácido sulfúrico, la temperatura de hidrólisis, el tiempo de hidrólisis (variables de entrada) versus la cantidad de azúcares fermentables (variable de salida) (Figura 20) Además, las Figuras 21 y 22 (Ver pag. Nº 64) muestran las superficies de contornos de la cantidad de azúcares fermentables versus las variables de salida antes mencionadas. Figura 20 Superficie de respuesta de la cantidad de azúcares fermentables versus concentración del ácido y temperatura (tiempo promedio) 63 Figura 21 Superficie de contornos de la cantidad de azúcares fermentables versus concentración del ácido y temperatura (tiempo de hidrólisis 180 min) Figura 22 Superficie de contornos de la cantidad de azúcares fermentables versus concentración del ácido y temperatura (tiempo de hidrólisis 240 min) 64 El modelo para la construcción de los gráficos antes mostrados es el que se observa en la Figura 23, proporcionado por el software utilizado. Además, el análisis de varianza en el que se basó el trabajo se muestra en el anexo 2 Figura 23 Ecuación de regresión en unidades no codificadas Finalmente, la optimización se realizó para cuando la cantidad de azúcares fermentables es máxima. Ante ello, se obtuvo que las condiciones más adecuadas de trabajo son: Concentración de ácido 2,78%, temperatura de hidrólisis de 120°C y tiempo de hidrólisis de 240 min (Figura 24) Figura 24 Optimización de las condiciones de hidrólisis ácida 5.3. Otro tipo de resultados estadísticos A continuación, se muestran los puntos y las curvas de calibración para la determinación de azúcares fermentables y la concentración de bioetanol obtenido de la fermentación (Tablas 8 y 9 Ver pag. Nº 66) 65 Tabla 8 Puntos de la curva de calibración Concentración de glucosa (g/L) vs Absorbancia Absorbancia Concentración de glucosa (g/L) 0,00 0,0 0,25 0,5 0,58 1,0 0,85 1,5 1,20 2,0 Tabla 9 Puntos de la curva de calibración Concentración de etanol (%) vs Índice de refracción Concentración de etanol (%) Índice de refracción 0 1,330 10 1,338 20 1,343 30 1,350 40 1,355 50 1,357 60 1,359 70 1,363 80 1,364 90 1,365 100 1,363 Para la determinación de las concentraciones de etanol se utilizó la primera parte de la curva mostrada en la figura anterior. Para ello se utilizaron los 5 primeros puntos y se hizo una regresión lineal (se muestra en el anexo 3) 66 VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1. Contrastación y demostración de la hipótesis con los resultados Contrastación con la hipótesis general Se acepta la hipótesis general, porque la evaluación estadística permitió determinar que había una gran influencia de las variables manipuladas sobre la variable de salida. El análisis de varianza proporcionó cifras de p–value menores a 0,05 para temperatura de hidrólisis y tiempo de hidrólisis (anexo 2), lo que confirma lo antes mencionado. En función a eso, la ecuación de regresión utilizada para la construcción de los gráficos de superficie de respuesta y contornos, así como la posterior optimización de las condiciones de operación (120°C; 240 min; y 2,78 g/L para la concentración de ácido sulfúrico).es adecuada. Las condiciones más favorables para la obtención de bioetanol a partir de la fibra de molle se obtuvieron luego de un control adecuado de la hidrólisis ácida y la fermentación alcohólica. Contrastación con las hipótesis específicas Se acepta la primera hipótesis específica. De acuerdo a lo propuesto, las condiciones más favorables de hidrólisis se encontrarían en los siguientes rangos: concentración de ácido: 1% a 4%, temperatura: 100°C a 120°C y tiempo: 180 a 240 min. Esto se corrobora en base a la evaluación de datos estadísticos, que encontró las condiciones más favorables para la hidrólisis ácida cuando la concentración del ácido es de 2,78%, temperatura de hidrólisis de 120°C y tiempo de hidrólisis de 240 min, valores que se encuentran dentro de lo propuesto. La segunda hipótesis específica se cumplió parcialmente. Para la fermentación, se propuso que la temperatura se encontrase entre 20°C y 30°C y que el tiempo de fermentación fuese de 24 a 48h, lo que fue correcto, porque se trabajó a una 67 temperatura de 25°C por 48 h. Sin embargo, la concentración de levadura utilizada estuvo entre 0,25 y 0,5 g/L, valores que se encontraron por debajo de lo planteado en la hipótesis. 6.2. Contrastación de los resultados con otros estudios similares En la presente investigación se obtuvo una mayor cantidad de azúcares fermentables para las pruebas en las que la temperatura de hidrólisis ácida fue de 120°C (pruebas 4,5; 6, 10, 11 y 12). Este comportamiento se mantuvo a pesar del tiempo de hidrólisis, que estuvo entre 180 y 240 minutos. Además, dichas muestras fueron las que presentaron una mayor conversión a bioetanol. Se observó también que se incrementó levemente la concentración de bioetanol cuando la fermentación se realizó con una concentración de levadura de 0,5 g/L. Vásquez (2019), en su investigación acerca de la obtención de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica presente en la cascarilla de arroz, reportó que la concentración más adecuada para la primera hidrólisis es de 2% de ácido sulfúrico. También menciona que la temperatura más adecuada para la hidrólisis es de 125°C por tiempos no tan prolongados, porque el ácido sulfúrico actúa de manera favorable para cualquier materia prima en un plazo no mayor a las 3 horas. En su investigación obtuvo una conversión de azúcares del 85%, que dista considerablemente de lo logrado en el presente trabajo, porque el tipo de materia prima utilizado es de una naturaleza diferente (5) Salsamendi (2013), obtuvo bioetanol a partir de pasto elefante. A diferencia del presente trabajo, la hidrólisis se realizó con hidróxido de sodio (hidrólisis básica) y posteriormente la fermentación se realizó con Saccharomyces cerevisiae, lo que produjo una concentración de bioetanol que se encontró alrededor de los 20% (17) Guevara (2020) obtuvo bioetanol a partir de cáliz de aguaymanto. También utilizó hidrólisis básica, porque de acuerdo con la autora, hizo este tipo de hidrólisis tuvo más 68 afinidad con su materia prima. También menciona que la fermentación tuvo mejores resultados cuando se usaron levaduras y obtuvo una cantidad de bioetanol de alrededor de 10% (8) Finalmente, los autores Gómez y Martín (2021), obtuvieron bioetanol de desechos de cáscara de plátano. Reportaron que la hidrólisis con 2 g/L de ácido sulfúrico fue la más adecuada. La fermentación de su materia prima con Saccharomyces cerevisiae produjo una concentración de bioetanol de aproximadamente 7% (4) Como se evidencia, en contraste con los estudios antes mencionados, de naturaleza similar a este trabajo, los resultados obtenidos en la presente investigación son concordantes. 6.3. Responsabilidad ética de acuerdo a los reglamentos vigentes El autor asume la responsabilidad de la información presentada en este estudio de investigación, siguiendo los principios establecidos en el Código de Ética de Investigación de la Universidad Nacional del Callao, según lo dispuesto en la Resolución N° 210–2017–CU.7 69 VII. CONCLUSIONES Se determinaron las condiciones más favorables para la obtención de bioetanol. Esto se logró maximizando la cantidad de azúcares fermentables, lo que permite alcanzar valores cercanos al 35% de bioetanol. Asimismo, se establecieron las condiciones óptimas para la hidrólisis de la madera de molle. A partir de la optimización mediante superficie de respuesta, se concluyó que la temperatura de hidrólisis ácida es de 120°C, durante 240 minutos y con una concentración de ácido sulfúrico de 2,78 g/L Además, se identificaron las condiciones favorables para la fermentación del hidrolizado de la madera de molle. Estas condiciones son: temperatura de fermentación de 25°C, durante 48 horas y con una concentración de 0,5 g/L, lo que resultó en el valor máximo obtenido de etanol, que fue del 38,67% 70 VIII. RECOMENDACIONES Se sugiere ampliar el espectro de análisis de los parámetros en futuras investigaciones, tanto para la hidrólisis ácida como para la fermentación (concentraciones, tipo de hidrólisis, tipo de levadura, entre otros) Se recomienda utilizar un método de control de temperatura adecuado en la hidrólisis ácida a 120°C. La evaporación del agua se da a 100°C, lo que dificulta un control preciso. Se recomienda utilizar más métodos de cuantificación de azúcares fermentables, así como explorar otros métodos para la determinación del porcentaje de bioetanol obtenido. Si bien los métodos utilizados en este trabajo son efectivos, podrían utilizarse otros para hacer la comparación respectiva de resultados. La biodiversidad de nuestro país es muy grande, y existen muchos tipos de materia prima que aún no se han estudiado y que podrían ser de mucha utilidad a futuro. Por eso se recomienda que se sigan haciendo este tipo de investigaciones, y de este modo saber cuáles podrían dar incluso un mejor rendimiento. 71 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1]. VIÑALS M, BELL A, MICHELENA G, RAMIL M. Obtención de etanol a partir de biomasa lignocelulósica. ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar. 2012; 46:7–16. https://www.redalyc.org/pdf/2231/223123848002.pdf [2]. BARRIENTOS FELIPA P. Los biocombustibles y su efecto en la agricultura peruana. Pensamiento Crítico. 2014; 10:043. https://www.researchgate.net/publication/322164017_Los_biocombustibles_y_su_ efecto_en_la_agricultura_peruana [3]. ORTIZ R, ARIAS T, MORALES U. Obtención de bioetanol a partir de cascarilla de cebada mediante hidrólisis ácida y fermentación. Universidad Nacional del Callao. 2019 https://repositorio.unac.edu.pe/handle/20.500.12952/5740 [4]. GÓMEZ G, MARTÍN G. Obtención de bioetanol mediante desechos de lacáscara de plátano. Fundación Universidad de América. 2021 https://repository.uamerica.edu.co/bitstream/20.500.11839/8687/1/6151513–2021– 2–IQ.pdf [5]. VÁSQUEZ S. Obtención de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica presente en la cascarilla del arroz para ser utilizados en equipos motorizados. Universidad Politécnica Salesiana. 2019 https://dspace.ups.edu.ec/handle/123456789/17633 [6]. GAREA A. Estudio de la obtención de bioetanol a partir de diferentes tipos de biomasa lignocelulósica. Matriz de reacciones y optimización. Escuela politécnica de ingeniería de minas y energía. 2017; 1:74. https://repositorio.unican.es/xmlui/bitstream/handle/10902/12178/RAF.pdf?sequen [7]. ALDANA G, VÁSQUEZ G. Influencia del tiempo, temperatura y dosis de reactivoen la concentración de glucosa en el pretratamiento ácido y alcalino de los residuos sólidos orgánicos. Universidad Nacional del Centro del Perú. 2019 https://repositorio.uncp.edu.pe/handle/20.500.12894/5995 72 [8]. GUEVARA J. Obtención de bioetanol a partir de cáliz de aguaymanto.Universidad Nacional Hermilio Valdizán [Internet]. 2020; Disponible en: https://repositorio.unheval.edu.pe/item/8b9aa884–88bc–4faf–a643–ed00a8e4bf3d [9]. CHIROQUE J. Capacidad de producción de bioetanol a través de la degradación de residuos sólidos orgánicos en Chiriaco, 2018. Universidad de Lambayeque. 2018;75. https://repositorio.uncp.edu.pe/handle/20.500.12894/5995 [10]. ZOLA M, BARRANZUELA M. Estudio experimental de obtención de bioetanol a banano orgánico en Piura, Perú. Universidad de Piura. 2017;1–55. https://www.academia.edu/78234649/Estudio_experimental_de_la_obtenci%C3%B 3n_de_bioetanol_a_partir_de_la_c%C3%A1scara_de_pl%C3%A1tano_en_Piura [11]. CIENTÍFICA DNDI. Biotecnología. Boletín estadístico tecnológico. 2018; 4:1– 12. [12]. PÉREZ Y, MONTENEGRO P. Obtención de bioetanol por hidrólisis enzimática y fermentación a partir de almidón de vituca (Colacasia esculenta) Lambayeque, 2015. 2016 https://repositorio.uss.edu.pe/handle/20.500.12802/3190 [13]. MONROY A, NARVÁEZ R, VERA B, BAUTISTA L. Generación de bioetanol como combustible alternativo a partir de compuestos lignocelulósicos a nivel laboratorio. Revista de Energía Química y Física. 2017;4(13):49–57. https://www.ecorfan.org/bolivia/researchjournals/Energia_Quimica_y_Fisica/vol4nu m13/Revista_de_Energia_Quimica_y_Fisica_V4_N13_7.pdf [14]. CORTÉS ORTIZ W. Materiales Lignocelulósicos Como Fuente De Biocombustibles Y Productos Químicos. Ciencia y Tecnología Aeronáutica. 2011;41–6. https://publicacionesfac.com/index.php/TecnoESUFA/article/view/366?articlesBySa meAuthorPage=18 [15]. LÓPEZ BERMÚDEZ Y, GARCÍA NASSAR J. Producción de bioetanol a partir de residuos de fruta utilizando Saccharomyces cerevisiae: una revisión de las diferentes condiciones y métodos de proceso. Universidad de los Andes. 2020;12. https://repositorio.uniandes.edu.co/entities/publication/2aeacaba–d670–4422–a27d– c2785d2785a4 73 [16]. PÉREZ JIMÉNEZ J. Estudio del pretratamiento con agua caliente en fase líquida de la paja de trigo para su conversión biológica a etanol. 2008. 234 p. https://ruja.ujaen.es/jspui/bitstream/10953/542/1/9788484398332.pdf [17]. SALSAMENDI L. Producción de bioetanol combustible a partir de Pasto Elefante: estudio de la hidrólisis enzimática y fermentación. 2013;1–81. https://silo.uy/vufind/Record/COLIBRI_bd6f0a59eb118f71220bddf0a88ce8b7 [18]. SACANDE M, VAUTIER H. Schinus molle. Danida Forest Seed Centre. 2002;(17):1– 2. [19]. ROBLES E. “Efecto biocida de Schinus molle L. “molle” (Anacardiaceae) para el control de Erosina hyberniata Guenée 1858 (Lepidoptera: Geometridae) en estado larval, plaga del Tecoma stans (L.) C. Juss. Ex Kunth. (Bignoniaceae) en el Distrito de Miraflores, Lima–Per. Universidad Ricardo Palma. 2014;1–147. https://repositorio.urp.edu.pe/entities/publication/0c12e285–4c45–4fef–b6d6– 29003094e7a5 [20]. BURGOS MONTAÑEZ L. Cuantificación de azúcares reductores del sustrato en residuos de piña con el método del ácido 3,5–dinitrosalicílico. Questionar Investig Específica. 9 de diciembre de 2020;7(1):57–66. https://revistas.uamerica.edu.co/index.php/rinv/article/view/326 [21]. MARTÍNEZ M, AMADO E. Índices de refracción, densidades y propiedades derivadas de mezclas binarias de solventes hidroxílicos con líquidos iónicos (1–etil– 3– metilimidazolio etilsulfato y 1–metil–3– metilimidazolio metilsulfato) de 298,15 a 318,15 k. Revista colombiana de química. 2011 https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/38053 74 ANEXOS 75 Anexo 1 Matriz de consistencia CONDICIONES FAVORABLES PARA LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIL DE MOLLE (Schinus molle) A NIVEL DE LABORATORIO PROBLEMA GENERAL OBJETIVO GENERAL HIPÓTESIS GENERAL VARIABLE DEPEND. DIMENSIONES INDICADORES MÉTODO ¿Cuáles serán las Determinar las Las condiciones más Y = Condiciones – Eficiencia de – Porcentaje de - Cuantificació condiciones más favorables condiciones más favorables para la favorables para la los procesos etanol obtenido n del volumen para la obtención de favorables de obtención obtención de bioetanol a obtención de bioetanol de obtención (valor máximo) de etanol por bioetanol a partir de molle de bioetanol a partir de partir de fibra de molle a partir de molle de bioetanol. destilación del (Schinus molle) a nivel de molle (Schinus molle) a son el adecuado control (Schinus molle) a nivel fermentado laboratorio? nivel de laboratorio. de la hidrolisis acida y a de laboratorio fermentación. - Análisis estadístico OBJETIVOS PROBLEMAS ESPECÍFICOS ESPECÍFICOS HIPÓTESIS ESPECÍFICAS VARIABLES INDEPEND. DIMENSIONES INDICADORES MÉTODO ¿Cómo determinar las Determinar las Las condiciones favorables X1= Condiciones – Eficiencia de - Concentració - Pruebas condiciones favorables en condiciones favorables en la hidrólisis se favorables de hidrólisis la hidrólisis n de ácido experimentales la hidrólisis de la madera en la hidrólisis de la encontrarán en los de la fibra de molle ácida - Temperatura de molle? madera de molle. siguientes rangos: de hidrólisis - Cuantificació Concentración de ácido: 1 - Tiempo de n de azúcares a 4% hidrólisis fermentables Temperatura: 100 a 120 °C mediante Tiempo: 120 a 240 min espectrofotomet ría uv–vis ¿Cómo determinar las Determinar las Las condiciones favorables X2= Condiciones - Temperatura de condiciones favorables en condiciones favorables en la fermentación se favorables de – Eficiencia de fermentación – Pruebas la fermentación del en la fermentación del encontrarán en los fermentación de la - Tiempo de experimentales fermentación de hidrolizado de la madera hidrolizado de la madera siguientes rangos: azúcares provenientes fermentación azúcar de molle? de molle Concentración de de la hidrólisis levadura: 5 a 10 g/L Temperatura: 20 a 30 °C Tiempo: 24 a 48 h 72 Anexo 2 Análisis de varianza 73 74 Anexo 3 Curvas de calibración Curva de calibración Concentración de glucosa (g/L) vs Absorbancia 2.5 2 1.5 y = 1.662x + 0.0427 1 R² = 0.9972 0.5 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Concentración de glucosa (g/L) Curva de calibración Concentración de etanol (%) vs Índice de refracción 1.37 1.365 1.36 1.355 1.35 1.345 1.34 1.335 1.33 1.325 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Concentración etanol (%) 75 índice de refracción Absorbancia Regresión de la curva de calibración Concentración de etanol (%) vs Índice de refracción 1.36 1.355 1.35 1.345 1.34 y = 0.0006x + 1.3308 R² = 0.9938 1.335 1.33 1.325 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Concentración de etanol (%) 76 Índice de refracción Anexo 4 Equipos de laboratorio Refractómetro Espectrofotómetro 77